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更高、更快、更强——噬菌体的筛选到定制的竞赛
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更高、更快、更强——噬菌体的筛选到定制的竞赛
作者：齐云龙
随着抗生素耐药性的不断加剧，噬菌体疗法逐渐成为抗击细菌感染的新希望，近年来作为替代抗生素治疗多重耐药细菌感染的一种选择正在受到越来越多关注。
然而，如何在众多噬菌体中快速识别出有效的治疗靶点或找到最佳的噬菌体，一直是该领域的一个难题。当前用以筛选噬菌体疗效的方法大多具有低通量且需要长时间，噬菌体疗法通常依赖于劳动密集型和耗时的方法，这会大大限制其潜力，给快速匹配可治疗病菌与适当噬菌体带来很大难度。
最近，两项重要的研究成果为我们展示了噬菌体疗法在快速识别和定制化治疗方面的新进展。今天，我们就来一起了解一下这些令人振奋的科学发现。
1. 高通量平台技术：快速识别噬菌体靶点
一项由加拿大学者发表于《Nature》子刊题为“High throughput platform technology for rapid target identification in personalized phage therapy（用于个性化噬菌体治疗中快速靶标识别的高通量平台技术）”的研究成果提供了一种高通量、快速的靶点识别技术，这对于个性化噬菌体治疗具有重大意义（从原来的过夜甚至几天缩短到0.5到2小时，可能会节省数十倍的时间）。
原理
噬菌体感染细菌后，通常会导致细胞裂解解释放大量ATP(三磷酸腺苷)。本研究采用了荧光素-荧光素酶的ATP生物发光反应检测细胞裂解解释放的ATP信号强度，间接反映噬菌体的裂解能力。为降低背景信号，所有噬菌体均经稀释处理；同时采用支链淀粉和海藻糖等糖质包被技术，可在37°C稳定保留酶的活性。
图注：
a 个性化噬菌体疗法
个性化噬菌体治疗的第一步是从患者中分离出耐药细菌菌株 （i），然后采用基于培养的慢速方法来筛选和选择治疗性噬菌体 （ii）。我们提出了一种用于治疗性噬菌体快速、高通量筛选的单片技术 （iii）。
b 噬菌体介导的ATP释放和检测
菌体介导的细菌细胞裂解始于噬菌体病毒粒子遇到宿主细胞并附着在特定的噬菌体受体上 （i），随后噬菌体基因组进入宿主细菌 （ii）。这引发了一连串的事件，导致细菌复制机制被劫持以合成新的后代噬菌体 （iii），最终导致宿主细胞裂解 （iv），并释放后代病毒粒子以及 ATP 爆发 （v）。ATP与荧光素反应形成荧光素腺苷酸，在镁存在下被荧光素酶氧化形成羟荧光素，CO2和磷酸腺苷 （AMP），导致发光 （vi）。
c 三种噬菌体 P32、JG004 和 PP7（每个噬菌体两个独立样品）的透射电子显微照片
d P32、JG004 和 PP7 在 Pa 培养皿上形成的斑块。
e 未感染和感染 （MOI = 10， 1， 0.1， 0.01， 0.001） Pa 培养物的代谢活性（n= 3，平均值 ± SD）。所有报告的值都是三个生物重复的平均值，显示为虚线的相关误差线表示与平均值的标准偏差。
研究方法
研究者首先选择了几种不同的噬菌体，并使用电子显微镜对它们进行了形态学分析。接着，他们利用XTT比色法和OD600比浊法，评估了这些噬菌体对细菌生长的影响。通过这些方法，研究者们能够直观地观察到噬菌体对细菌的杀伤效果。
优点
高通量：每份样品皆可独立进行，同时检测多个噬菌体-细菌对。
快速：仅需30-120分钟就能获知噬菌体对靶细菌的作用强度。
简单：所有试剂预包被成片，只需加入细胞后即可检测，无需分步添加试剂。
稳定性好：糖质包被可在室温下多日或月内保留试剂及噬菌体活性。
成本低：制作成本低，运输中无需特殊条件，适用于资源匮乏地区。
研究创新
在这项研究中，研究者设计了一种高通量噬菌体筛选平台。这一平台的核心是一种便携式的噬菌体库，每个噬菌体都封装在一个固态药片中。这些药片不仅包含噬菌体本身，还包含检测噬菌体介导的细菌细胞裂解所需的所有生化试剂。通过检测噬菌体介导的ATP释放，研究者们能够快速识别出有效的治疗噬菌体。
应用前景
作者通过筛选铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等多重耐药株的靶噬菌体展示了高通量筛选平台的性能，可在 30-120 分钟内鉴定出靶噬菌体——要知道目前噬菌体筛选的通行标准是现场测试，是基于细菌培养的方法，根据目标细菌的不同，耗时很长，从过夜到几天不等。
这项技术的成功，为个性化噬菌体治疗提供了一种快速、可靠的筛查方法。通过这种技术，研究人员可以更容易地在全球范围内运输和储存噬菌体，大大提升了噬菌体疗法的可及性。未来，这种技术有望在临床治疗中发挥重要作用，尤其是在抗生素耐药性日益严重的背景下。
2. 数据驱动工程：定制化噬菌体
噬菌体对特定宿主的特异性限制了其应用范围。为了克服这一难题，研究人员一直在探索如何通过工程化手段来定制噬菌体，提升杀菌效率、扩宽宿主谱、增强安全性，为未来创新带来更多机遇。
近日，中国科学院微生物研究所冯婕团队、吴林寰团队和中国疾病预防控制中心传染病预防控制所周海健团队合作在期刊《Advanced Science》上发表题为“Data‐Driven Engineering of Phages with Tunable Capsule Tropism for Klebsiella pneumoniae”的文章。该研究使用安全的噬菌体通用底盘，并整合明确功能的噬菌体受体结合蛋白（Receptor binding protein, RBP），从而构建具有明确宿主范围的噬菌体。这一方法简化了合成噬菌体疗法的开发过程，通过提供具有可定制靶向能力的标准化平台，使标准化监管过程成为可能。
研究内容
解密噬菌体与细菌相互作用的分子机制是工程化噬菌体的基础。研究团队分析了的噬菌体-宿主相互作用矩阵，从 27132 个相互作用中获得了 3021 个裂解表型的数据。通过将这些相互作用数据与噬菌体基因组序列整合，发现了噬菌体RBP与肺炎克雷伯菌荚膜抗原之间的对应规律，鉴定了6个识别不同肺炎克雷伯菌荚膜抗原的RBP簇。团队还鉴定出了具有识别和结合多种荚膜抗原的RBP，这种RBP的噬菌体具有广宿主谱。本研究中鉴定的RBP为定制靶向不同荚膜抗原的噬菌体提供了工具箱。
了解 RBPs 之后即可更高效地操纵噬菌体，通过替换RBPs来改变它们的宿主或扩展它们的宿主范围。研究团队选择安全的噬菌体作为底盘，将明确功能的RBP整合到底盘噬菌体中，成功地构建了工程化噬菌体（图3），改变了它们的宿主荚膜专一性，将特异性从 KL2 转变为 KL57。此外，还扩展了宿主荚膜范围，从单一的感染一种荚膜类型扩展到可感染具有 KL1、KL2 和 KL57 荚膜的宿主。本研究经过工程化的噬菌体表现出了裂解临床菌株的能力，而不仅仅是实验室菌株，这展示了它们在实际场景中的可应用性。此外，将单个噬菌体作为基本底盘，并仅通过替换已表征的 RBPs 来改变其荚膜专一性，可以在噬菌体通用底盘的基础上创建更均一化的噬菌体，简化了治疗方法，提高了治疗的安全性。
图. 构建通过交换受体结合蛋白 (RBP) 的工程噬菌体，改变宿主荚膜专一性
这项研究的意义不仅在于为治疗肺炎克雷伯菌感染提供了新的解决方案，更在于为开发针对其他细菌感染的噬菌体疗法提供了新的思路。随着噬菌体工程化技术的不断发展，相信未来会有更多针对不同细菌感染的精准噬菌体疗法问世，为人类对抗细菌感染带来新的希望。相信随着科学技术的不断进步，噬菌体疗法将成为对抗细菌感染的重要武器，为人类健康保驾护航。
该研究成果发表在 Advanced Science 期刊上，中国科学院微生物研究所王超副研究员、荆世松博士生和西北大学王世伟教授为文章的共同第一作者，中国科学院微生物研究所冯婕研究员、吴林寰正高级工程师和中国疾控中心传染病所周海健研究员为共同通信作者。该研究工作得到了科技基础资源调查专项和国家自然科学基金专项项目的资助（冯婕老师团队的成果摘自其在“上海噬菌体与耐药研究所”公众号上的介绍）。
在医疗科学的征途上，与时间的赛跑往往关乎生命的存亡。每一次快速的噬菌体筛选，不仅是为了加速治疗的进程，更是在与病魔争夺宝贵的生命时光。在这场与时间的竞赛中，我们需要不断突破极限，力求以更快的速度、更高的效率，为患者带来生的希望，让噬菌体疗法成为守护人类健康的坚强盾牌。
“更高、更快、更强”——这是奥林匹克运动会精神的核心价值观，也是我们在噬菌体治疗领域不懈追求的信条。我们努力提升噬菌体的感染效率，追求更高的特异性和更为强大的治疗效力，以确保每一次治疗都能精准击中目标。我们致力于实现更快的筛选流程和更迅速的响应机制，以期在抗击细菌耐药性的竞赛中取得先机。同时，我们也在不断强化噬菌体的抗性克服能力、稳定性、安全性和适应性，确保它们在多变的医疗环境中依然能够发挥出色的作用。
我们坚信，通过不断地创新和突破，噬菌体疗法将为人类健康事业贡献出更加强大的力量，开启个性化医疗的新篇章。
参考文献
Bayat, F., Hilal, A., Thirugnanasampanthar, M. et al. High throughput platform technology for rapid target identification in personalized phage therapy. Nat Commun15, 5626 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-49710-2.
Wang C, Wang S, Jing S, et al. Data‐Driven Engineering of Phages with Tunable Capsule Tropism for Klebsiella pneumoniae[J]. Advanced Science, 2024: 2309972.
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