在斯洛文尼亚蝙蝠身上发现一种新的蝙蝠狂犬病病毒

狂犬病是一种人畜共患的致命疾病=。在过去的十年里，欧洲发现的蝙蝠相关病毒也在增加。在一项与蝙蝠相关的狂犬病病毒监测研究中，2012年至2019年期间，在斯洛文尼亚收集了21种蝙蝠共225只死亡蝙蝠，并通过特定的实时RT-PCR方法进行了测试。使用实时RT-PCR、荧光抗体测试和下一代测序在斯洛文尼亚的蝙蝠中检测到第一个丽莎病毒阳性样本，而狂犬病组织培养接种测试由于样本降解和储存条件而失败。来自斯洛文尼亚的Divača蝙蝠丽莎病毒的几乎完整的基因组由11，871个核苷酸组成，反映了已知的丽莎病毒的特征性基因组织，编码五种病毒蛋白。Divača蝙蝠丽莎病毒的系统发育分析表明，它属于系统群I 丽莎病毒，与Kotalahti bat 丽莎病毒 (KBLV)的亲缘关系最近，具有87.20%的核苷酸和99.22%的氨基酸同一性。与KBLV、Khujand病毒、欧洲蝙蝠丽狂犬病毒 2、Bakeloh蝙蝠狂犬病病毒和Aravan病毒一起，在Myotis属中检测到Divač a蝙蝠丽莎病毒，表明其在某些丽莎病毒的传播和维持中起关键作用。

介绍

蝙蝠属于哺乳动物目翼手目。参见MEGACHIROPTERA，拥有21科1460多种蝙蝠。它们广泛分布于除南极洲之外的所有大陆，并通过它们的粪在种子传播、授粉和有机施肥中发挥重要作用。蝙蝠是病毒的天然宿主，这些病毒是从野生动物传播给人类的最致命的病毒之一，包括狂犬病和SARS冠状病毒。作为新出现的病毒性人畜共患疾病的宿主，蝙蝠还携带来自至少28个不同病毒家族的病毒，其中大多数可能是宿主特异性的，并具有有限的人畜共患潜力。蝙蝠中的病毒性人畜共患病的数量与其他哺乳动物或鸟类中的病毒性人畜共患病的数量相当，因为动物群体中病毒性人畜共患病数量的变化是其物种丰富性的结果。

首次描述的与蝙蝠有关的动物传染病是狂犬病，一种由该属成员引起的人畜共患致命疾病狂犬病病毒在亚科内甲状病毒亚科，家庭弹状病毒科，订单单阴性病毒。狂犬病病毒是子弹形包膜病毒，具有大约12kb长的线性单链负向RNA基因组，编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依赖性聚合酶(L) 。根据分类学的分类，属狂犬病病毒目前由17种不同的病毒组成。根据最新的ICTV报告[9]，此处提供了丽莎病毒的名称，随后是用于识别其分离物的传统缩写:Aravan病毒(ARAV)、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒 (ABLV)、Bokeloh蝙蝠狂犬病病毒 (BBLV)、西高加索蝙蝠狂犬病病毒(WCBV)、Duvenhage病毒(DUVV)、台湾蝙蝠狂犬病病毒 (TWBLV)、Gannoruwa蝙蝠狂犬病病毒 (GBLV)、欧洲蝙蝠丽狂犬病毒 1 (EBLV-1)、欧洲蝙蝠狂犬病病毒 2 (EBLV-2)、生驹狂犬病病毒 (IKOV)、伊尔库特病毒(IRKV)、Khujand。最近，已经描述了两种潜在的新型狂犬病病毒，Kotalahti蝙蝠狂犬病病毒(KBLV)和Matlo蝙蝠狂犬病病毒(MBLV )。除了丽莎病毒属中的两个病毒种MOKV和IKOV之外，所有的丽莎病毒都与蝙蝠有关，蝙蝠被认为是原始的原始宿主。在欧洲，已经在人类中描述了涉及EBLV-1、EBLV-2和WCBV的食虫蝙蝠传播的狂犬病病毒感染，猫，绵羊和石貂。所有狂犬病病毒都被认为能够引起中枢神经系统感染，导致急性进行性脑脊髓炎以及未接种疫苗的人如果治疗不当会死亡。

根据系统发育和抗原特征，狂犬病病毒分为两个系统群。ABLV、ARAV、BBLV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、GBLV、IRKV、KBLV、KHUV、RABV、TWBLV代表类群I，而LBV、MOKV和SHIBV代表类群II。第一和第二类群的分类不能用于最不同的狂犬病病毒IKOV、LLEBV、MBLV和WCBV。糖蛋白基因的最高核苷酸序列相似性在系统群II中描述，平均为71.5%，其次是系统群I，相似性为70.3%，不属于系统群I和II的狂犬病病毒组(IKOV，LLEBV，MBLV，WCBV)相似性为58.2%。根据Fooks等人，狂犬病疫苗对属于不属于第一和第二类群的狂犬病病毒组的最不同的狂犬病病毒(IKOV、LLEBV、MBLV、WCBV)无效。

在欧洲，1954年德国首次报道蝙蝠患狂犬病。通过随后对欧洲蝙蝠中狂犬病病毒基因组的分子分析，描述了经典RABV和EBLV 1和2之间的区别。在欧洲蝙蝠中，在血清素蝙蝠和褐黄蝙蝠。在欧洲蝙蝠物种道本顿蝙蝠和池塘蝙蝠、WCBV中常见的弯翼蝙蝠、LLEBV中常见的弯翼蝙蝠，Natterer的蝙蝠中的BBLV(鼠耳蝠) ，以及勃兰特《蝙蝠》中的KBLV(布氏鼠耳蝠) 。

在这篇手稿中，我们描述了在斯洛文尼亚的一个食虫蝙蝠物种中发现了一种以前未知的蝙蝠相关的丽莎病毒，Divača蝙蝠丽莎病毒，并描述了其遗传特征，这是国家回顾性监测计划的结果。根据全基因组测序和系统发育分析，Divača蝙蝠丽莎病毒和KBLV可能代表欧洲一个推定的新丽莎病毒物种。

材料和方法

抽样

在2012年至2019年期间，蝙蝠生物学家或志愿者从斯洛文尼亚的59个城市(共212个)收集了21个蝙蝠物种的225只死蝙蝠，并冷冻保存(S1表).将收集的死蝙蝠提交给国家兽医研究所微生物学和寄生虫学研究所病毒学部门进行狂犬病病毒诊断。蝙蝠生物学家提供了蝙蝠种类、位置(自治市)和采集年份的信息。根据Dietz和Halversen 。来自狂犬病病毒阳性蝙蝠样本PP-0868/2014的宿主物种的其他分子特征，其中NGS读数被映射到细胞色素b和细胞色素c氧化酶亚基I ，确认原作业分类为电容鼠耳蝠.

通过吸液管吸取通过枕骨大孔收集脑样本。吸出脑组织后，用RPMI-1640培养基(Thermo Fisher，美国)冲洗颅腔。将收集的脑组织在总体积为500 μl的RPMI-1640培养基(Thermo Fisher，美国)中匀浆，然后在<-60℃下长期储存

斯洛文尼亚共和国环境署颁发了第35601-35/2010-6号许可证，允许捕获、干扰和临时从野外采集受保护动物并对其进行采样。

诊断方法

为了对狂犬病病毒进行分子检测，根据制造商的说明，使用KingFisher Flex纯化系统(Thermo Fisher，USA)和MagMax核心核酸纯化试剂盒(Thermo Fisher，USA)对脑组织匀浆进行自动化RNA提取。提取的RNA通过实时RT-PC来检测狂犬病病毒。使用三个特异性引物LN34forward1、LN34forward2和LN34reverse以及两个探针LN34probe和LN34probeLago靶向核蛋白基因区域内的高度保守序列进行实时RT-PCR被执行。

当通过实时RT-PCR检测到丽莎病毒阳性样品PP-0868/2014时，通过打开颅腔对蝙蝠尸体重新取样以获得脑样品，对脑样品进行如前所述进行的荧光抗体测试(FAT )。

如前所述，从丽莎病毒阳性样品PP-0868/2014中进行RTCIT。进行三次连续的连续传代以获得RTCIT结果。

全基因组测序和系统发育分析

使用Novogene的NGS服务(英国剑桥)对狂犬病病毒阳性样品PP-0868/2014进行下一代测序(NGS)以确定狂犬病病毒的完整基因组序列。从提取RNA到最终数据，Novogene的服务包括样品制备、质量控制、使用RIP-seq文库制备试剂盒(Illumina，美国)构建文库、文库质量控制、在NovaSeq 6000 (Illumina，美国)上测序、使用NovaSeq PE150试剂盒(Illumina，美国)以及数据质量控制。NGS阅读被用于SPAdes 3.13.0 。Diamond BLASTx和MEGAN 6.11.7 用于组装的重叠群的分类分配。被命名为Divača蝙蝠丽莎病毒(样品PP-0868/2014的原始名称)的组装的丽莎病毒基因组的核苷酸序列以登录号OQ428158保存在GenBank数据库中，并与17种丽莎病毒物种和2种推定的丽莎病毒物种的其他基因组进行比较，并使用Geneious 20221.1 (Biomatters，新西兰)进行注释。使用MAFFT 构建核苷酸和氨基酸比对。使用IQ-TREE 1.6.12进行系统发育分析，带模型查找器根据BIC评分和1000次超快速引导复制确定最佳模型用于测试树的可靠性。

结果

通过实时RT-PCR、FAT和RTCIT进行病毒检测

来自21种不同蝙蝠物种的225个测试样本中的一个样本(原名PP-0868/2014)S1表)经实时RT-PCR检测为丽莎病毒阳性，循环阈值为21.82。样本PP-0868/2014来自物种长指蝙蝠(能力鼠耳蝠)在2014年收集的diva ca市kocjan洞穴内约700米处被发现死亡。蝙蝠尸体在腐烂的高级阶段被发现，并被储存在<-20℃下，直到2020年收集大脑。对丽莎病毒阳性脑样品PP-0868/2014进行进一步分析，即脂肪和RTCIT。用FITC抗狂犬病单克隆球蛋白染色的脂肪载玻片显示出典型的狂犬病病毒染色的阳性结果。连续三次传代后，在RTCIT上未检测到PP-0868/2014的病毒生长。

全基因组测序和系统发育分析

将来自丽莎病毒阳性样品PP-0868/2014的病毒RNA进行NGS以确定完整的基因组序列，命名为 Divača蝙蝠丽莎病毒。NGS产生了13，048，710个原始读数，用于重新组装。产生了总长为11，871个核苷酸(每个核苷酸位点的平均序列深度为135，333个核苷酸)的几乎完整的狂犬病病毒基因组序列，以狂犬病病毒典型的高度保守顺序编码五个基因，N、P、M、G和L。N、P、M、G和L蛋白基因的长度分别为1356 nt、894 nt、609 nt、1581 nt和6384 nt。发现Divača蝙蝠丽莎病毒的基因长度和基因间间隔区与来自系统群I的所有丽莎病毒相似。

组装的Divač a bat赖萨病毒、17种赖萨病毒和2种推定的赖萨病毒(图1)显示Divač a 蝙蝠丽莎病毒与I类丽莎病毒(图1)并且与KBLV最接近，具有87.20%的核苷酸和99.22%的氨基酸同一性(表1).在N基因以及P、M、G和L基因中发现了与KBLV相似的核苷酸和氨基酸同一性。Divač a bat 丽莎病毒与GenBank中其他丽莎病毒物种之间的N、P、M、G、L和串联的N+P+M+G+L基因的核苷酸和氨基酸同一性百分比显示在中表1。

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图1.N+P+M+G+L最大似然系统树。

通过IQ-TREE，使用具有1000个超快速引导复制的GTR+F+I+G4替代模型，用具有代表性的17种赖萨病毒、2种试验性赖萨病毒和Divač a蝙蝠赖萨病毒(用蓝点表示)的串联N+P+M+G+L编码序列构建最大似然系统发育。节点处的数字表示超快引导支持，比例尺表示每个位点的替换数。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011420.g001

表1.19种不同的狂犬病病毒的N、P、M、G、L和串联的N+P+M+G+L基因与Divača蝙蝠狂犬病病毒的Nt和aa %同一性。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0011420.t001

讨论

在欧洲已经实施了几个蝙蝠狂犬病病毒监测系统，结果表明，对于狂犬病病毒检测，被动或回顾性监测优于主动监测。在这项研究中，在2012年至2019年期间进行了一次回顾性调查，从生活在斯洛文尼亚的32种蝙蝠中的21种收集了225具尸体。在两个中的一个中发现了狂犬病病毒电容鼠耳蝠尸体。根据在特定蝙蝠物种中检测到的一次狂犬病病毒，我们不能确定电容鼠耳蝠是Divača蝙蝠丽莎病毒的真正宿主。Nokireki等人报告了类似的结果和结论，他在2004年描述了假定的新狂犬病病毒种KBLV布氏鼠耳蝠也只发现一个KBLV阳性样本。然而，后来一项关于KBLV研究的作根据从鼠耳蝠属的蝙蝠物种中也分离出了密切相关的第一组狂犬病病毒的数据，布氏鼠耳蝠可能是一个储存宿主，没有被其他蝙蝠物种的溢出感染。

这项研究是第一次报道在电容鼠耳蝠一种蝙蝠，其中已描述了来自星状病毒科(3)、冠状病毒科(6)、疱疹病毒科(2)和副粘病毒科(1)的几种病毒。蝙蝠感染狂犬病病毒在世界各地都有发生，尽管不同的病毒种类出现在不同的地区，共同进化，因此与特定的蝙蝠种类有关。在美洲，只有RABV与蝙蝠有关，而在欧洲、非洲、亚洲和澳大利亚，其他狂犬病病毒占主导地位，而RABV与蝙蝠无关。在欧洲，许多蝙蝠物种已经被确认感染了狂犬病病毒。然而，没有蝙蝠物种发现狂犬病病毒的报道电容鼠耳蝠.

使用NGS，产生了Divača蝙蝠丽莎病毒的几乎完整的基因组序列，并进行了系统发育分析。根据ICTV，对丽莎病毒属的新种进行分类有几个标准。新物种的完整N基因的核苷酸同一性应小于78–80 %,或者N+P+M+G+L的串联编码区的核苷酸同一性应小于80%。diva a蝙蝠丽莎病毒与推定的新丽莎病毒物种KBLV最接近，对于连接的N+P+M+G+L基因和N基因分别具有87.20%和87.09%的核苷酸同一性，这表明diva a bat 丽莎病毒和KBLV属于相同的推定的新丽莎病毒物种。ICTV的另一个划界标准要求新病毒不应代表连接的N+P+M+G+L的系统发育树中已确定物种的病毒的姐妹分支。连接的N+P+M+G+L的系统发育分析显示，Divača蝙蝠丽莎病毒代表推定的新丽莎病毒物种KBLV的姐妹分支，这再次表明Divača蝙蝠丽莎病毒和KBLV是同一推定的新丽莎病毒物种的成员。ICTV将新的狂犬病病毒物种与其他狂犬病病毒物种的血清学区分也是新的狂犬病病毒物种的物种划分标准之一，但在我们的研究中，Divača蝙蝠狂犬病病毒无法进行血清学评估。ICTV最后的划界标准一个新的狂犬病病毒物种占据了独特的生态位，如宿主物种、病理生物学特性或地理范围所证明的。Divača蝙蝠丽莎病毒占据了特定的生态位，因为它与KBLV来自不同的宿主，在不同的地理位置也检测到了KBLV(图2)。将所有四个ICTV标准放在一起对新的Divača蝙蝠丽莎病毒进行分类学分类，即使它是在距离密切相关的KBLV近2000公里的新宿主物种中发现的，我们也认为Divača蝙蝠丽莎病毒和KBLV都是同一假定的新丽莎病毒物种的成员。

如前所述，Divača蝙蝠丽莎病毒与KBLV关系最密切。在2017年在芬兰布氏鼠耳蝠中检测到KBLV。在斯洛文尼亚，布氏鼠耳蝠是非常罕见的，然而，它是在什科奇扬洞穴附近被发现的。之间的联系电容鼠耳蝠，环地中海分布的物种几乎完全栖息在洞穴里，和布氏鼠耳蝠，在欧洲分布较广的种主要栖息在树洞和裂缝中，仍不清楚，因为它们通常不分享栖息地。芬兰的Kotalahti和斯洛文尼亚的Diva之间的地理距离相当大，为1886公里(图2)。由于遥远的地理距离和两种宿主物种布氏鼠耳蝠和电容鼠耳蝠大多数是区域移民，我们可以推测，类似于KBLV和Divača蝙蝠丽莎病毒的丽莎病毒可能存在于斯洛文尼亚和芬兰之间的其他欧洲国家，这表明需要监测计划和提高公众意识。

尽管我们努力从样本PP-0868/2014中分离出活病毒，但并未成功，因此无法评估传统狂犬病疫苗的疫苗效力。然而，根据将Divača蝙蝠丽莎病毒归入系统群I以及与KBLV的高度序列同一性，我们可以推测常规狂犬病疫苗具有良好的交叉保护作用。

我们认为Divača蝙蝠丽莎病毒的完整基因组序列及其与我们研究中鉴定的其他丽莎病毒的系统发育关系可能对丽莎病毒属的未来研究有用。对于进一步的研究，从细胞培养的野外样品中分离将是对该菌株进行额外分析的可能性的重要一步。

总之，Divač a 蝙蝠丽莎病毒与KBLV关系最密切，后者被认为是丽莎病毒属中的一个独立物种。先前发表的关于KBLV的研究表明，它属于狂犬病疫苗提供保护的狂犬病病毒的第一组。需要持续的被动监测以获得传染性狂犬病病毒，从而评估与公共卫生相关的疫苗的效力。由于Divač a 蝙蝠丽莎病毒与KBLV具有最大的遗传相似性，如果采取预防措施，如对蝙蝠看护者进行疫苗接种和在人与蝙蝠接触后进行预防性治疗，则可以认为它对公共健康的风险较低。

Černe D, Hostnik P, Toplak I, Presetnik P, Maurer-Wernig J, Kuhar U. Discovery of a novel bat  lyssavirus in a Long-fingered bat (Myotis capaccinii) from Slovenia. PLoS Negl Trop Dis. 2023 Jun 29;17(6):e0011420. doi: 10.1371/journal.pntd.0011420. PMID: 37384601; PMCID: PMC10309629.