一种测定狂犬病毒中和抗体的简化方法

摘要

狂犬病病毒(RABV)会导致一种致命的脑炎，可以通过及时接种疫苗来预防。可以使用荧光抗体病毒中和(FAVN)试验来测量由疫苗接种诱导的针对狂犬病病毒的病毒中和抗体的水平。将活病毒与血清孵育后，该方法包括固定细胞单层，并使用异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗体对狂犬病毒特异性抗原进行染色，从而能够使用荧光显微镜观察狂犬病毒抗原。为了简化该程序，使用反向遗传学构建荧光重组狂犬病病毒，通过在SAD B-19基因组的核糖核蛋白基因前插入mCherry荧光蛋白的基因，并用攻击病毒标准(CVS)-11 RABV株的糖蛋白替换其糖蛋白，以确保FAVN的抗原真实性。这种新的重组病毒(称为mCCCG)高水平表达mCherry蛋白，能够直接观察感染的细胞。在试管内mCCCG的生长动力学与CVS-11的难以区分.重组病毒的稳定性通过对拯救病毒的几次传代进行测序来评估，仅检测到微小的变化。使用产mCherry病毒(NTmCV)对FAVN进行的病毒中和试验的比较评估表明，试验结果彼此相当；因此，mCCCG可作为CVS-11的替代物用于测量抗狂犬病病毒的抗体滴度。NTmCV的使用消除了对昂贵的抗体结合物的需求，并显著减少了分析时间。这对于资源有限的环境中的RABV血清学评估尤其有益。此外，可以使用细胞成像读取器自动读取板的读数。

关键词

狂犬病 中和抗体FAVN荧光病毒NTmCV mCherry

1. 介绍

狂犬病在临床疾病发作后几乎是100%致命的；然而，它可以通过暴露前预防(PrEP)或暴露后及时预防(PEP)得到有效预防。前者包括多次注射疫苗。后者包括一系列疫苗接种，如有必要，对于III类暴露，应用狂犬病免疫球蛋白(RIG)。建议有职业暴露风险的人和去流行国家旅行的人接种疫苗以及用于控制/消除动物宿主中的疾病。中和抗体是针对狂犬病病毒的保护性免疫反应的关键成分，并且主要针对病毒糖蛋白(G)。病毒中和试验用于测量疫苗接种后的抗体反应，评估新疫苗或疫苗给药方案、疫苗接种的有效性，以及促进伴侣动物。按照以下两种方案之一评估提交样品中的中和抗体滴度:狂犬病快速荧光灶抑制试验(RFFIT)或荧光抗体中和试验(FAVN)。在这项研究中，遵循FAVN方案，并且当使用在这项研究中构建的病毒时，应用缩短的版本。

通过评估不同稀释水平的血清中和活病毒并因此防止细胞单层感染的能力来确定血清滴度。在血清不能中和病毒的情况下，在使用固定剂(例如丙酮或多聚甲醛，PFA)固定细胞单层后，观察病毒抗原，并在结合异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗体后检测病毒核糖核蛋白(N)抗原。血清滴度定义为半数孔未检测到病毒抗原时稀释度的倒数。在与标准化参考血清(截止值定义为0.5 IU/ml)中和标准化输入的活病毒。

大多数狂犬病血清学实验室依靠FITC结合抗体的商业供应来进行血清学试验。在流行地区，国际认可的抗体偶联物的供应可能是有问题的，而且是昂贵的。为了简化这一过程，先前的研究报道了基于荧光团的方法，包括构建含有插入在HEP-Flury株的糖蛋白(G)基因和聚合酶(L)基因区域之间的eGFP基因的荧光病毒；或者CVS-11；或者与磷蛋白(P)基因融合。另一份报告描述了表达荧光蛋白的狂犬病病毒的产生，该荧光蛋白用核定位信号标记，以确保荧光报道蛋白易位到受感染细胞的细胞核，然后可以用配备有自动计数软件。

虽然这些先前的研究从使感染细胞能够直接可视化的角度来看是有用的，但是需要更长的孵育时间来确保指示感染细胞的荧光蛋白的可视化的足够表达。因此，这些方法会影响测试周转时间。这种延迟可能是荧光蛋白相对于病毒启动子的次优定位的一个因素，因为病毒基因的表达水平依赖于定位，由此3’近端基因表达到更高水平，并且随着基因变得更加远离3’基因组末端，表达降低，这与已建立的转录梯度一致。为了最大化荧光蛋白的表达，并旨在减少检测荧光蛋白的时间，从而减少病毒感染，将编码mCherry的基因作为一种新的转录盒插入到基因组的3’末端，在3’非翻译基因组启动子区和病毒的初级转录单位之间。使用反向遗传学从DNA克隆中产生活病毒，并对产生的重组病毒进行表征在试管内和在活生物体内并直接对照FAVN方法进行评估，以确定其作为该分析替代方法的潜力。

2. 方法

2.1. 质粒构建和病毒拯救

在补充文件(S1.1和S1.2)中描述了产生mCherry的狂犬病病毒的质粒构建、拯救和表征。在传代(p) p3、p7和p15时测定病毒的完整基因组序列，以确认拯救的病毒的序列，并评估在连续传代期间引入的任何突变(S1.3)。

2.2. 用多聚甲醛(PFA)固定并用FITC结合的抗体染色

为了观察被狂犬病病毒感染的细胞单层，在用异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗体对病毒N蛋白进行染色之前，通常使用丙酮来固定细胞。然而，丙酮使mCherry的荧光猝灭。为了直接比较来自mCherry的荧光信号和来自FITC偶联抗体的荧光信号，需要使用PFA。被mCCCG感染的细胞单层用0.1 并在4%多聚甲醛(Affymetrix，19943)中固定30分钟 室温下分钟。然后将细胞用0.1 M PBS，并根据进行FAVN时的标准程序用FITC结合的抗体(Fujirebio)染色不同的是用4%多聚甲醛代替80%丙酮。

2.3. 病毒滴定和生长曲线

将病毒滴度确定为50%组织培养感染剂量(TCID₅₀)使用斯皮尔曼和卡尔伯技术。每种拯救的病毒制剂以10倍系列稀释至10倍的方式滴定，一式三份-8在补充了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素(Gibo.15140)的G-MEM (Gibco 21710-025)中。胰蛋白酶消化的BHK-21细胞(介于4.0 - 5.0 ×10⁵)添加到96孔板的每个孔中，并在 37℃5% CO₂ 孵育48小时。如前所述，以0.01的起始MOI进行多步生长曲线。

2.4. 在活生物体内致病性评估

在小鼠中测试mCCCG的致病性，以评估处理该病毒的安全性。补充文件中提供了方案和伦理批准的详细信息(S1.4)。

2.5. 血清学评估

作为宠物旅行计划的一部分，从提交给APHA的接种过疫苗的猫(n=35)和狗(n=75)获得的血清样本被用于评估新的分析。选择FAVN滴度值在0.00至1093.39 IU/ml范围内的一组样品，并使用NTmCV(使用mCherry标记病毒的中和试验)。测试程序与FAVN的相同，除了在荧光显微镜下直接观察未中和的复制型病毒(激发滤光片542-582和发射滤光片603-678 nm )，无需固定和染色程序。血清学滴度表示为倒数滴度(即。如果50%孔中的狂犬病毒被1:9稀释度的血清中和，则滴度为9。此外，通过与同一天测试的标准化WOAH狂犬病狗参考血清(ANSES)的结果进行比较，滴度也转换为IU/ml。所有统计数据分析均使用Microsoft Excel 2013数据分析包或GraphPad Prism (8.4.2)进行。将FAVN和NTmCV的对数转换滴定数据进行比较，并应用Bland-Altman分析。

2.6. 使用Cytation 5自动读取板

使用Cytation 5细胞成像多模式阅读器(安捷伦科技公司)读取和分析结果。所使用的模型配置有2.5x物镜、明场照明系统和德克萨斯红光立方体(激发滤光器529-585和发射滤光器624-640 nm)。自动阅读器使用带有带通滤波器和分色镜的LED光源提供适当的波长。该机器需要专用的黑壁板，并且通过捕捉每个完整孔的12个重叠图像的蒙太奇来对板进行成像。然后使用Gen5软件对捕获的图像进行分析和处理。

图像分析分两个阶段进行，使用明场系统评估细胞单层，使用德克萨斯红过滤器评估细胞的mCCCG感染。为了确保准确的评估，每个平板包括一个细胞对照，作为合适细胞单层的校准参考，并用于设定阈值标准。只有当每个孔具有合适的细胞单层时，才启动第二阶段，并进行mCCCG病毒感染的评估。具有不完全细胞融合或任何细胞毒性效应的孔被识别并从评估中排除。

为了检测mCherry信号，通过使用一系列含有感染和未感染细胞的微量滴定板来排除非特异性荧光(假阳性)或假象，从而建立最佳阈值。随后，人类和机器都读取NTmCV板，并比较结果。

3. 结果

3.1. 表征、生长评估在试管内和病毒的致病性

病毒构建、拯救、测序和在活生物体内补充文件(S2.1和S2.2)中描述了特性。拯救的病毒在BHK-21和N2A细胞中生长。病毒达到了可达到的最大滴度1 ×10⁸TCID₅₀/ml。当感染的细胞被固定并用抗-N异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗体染色时，如预期的那样，检测到核衣壳抗原为颗粒状核周聚集物(图1a)虽然mCherry表达被认为在整个细胞中普遍存在(图1b)。

图1. BHK-21细胞以0.04的MOI感染mCCCG，并生长72 几个小时。然后用4% PFA固定细胞，并用针对核糖核蛋白(N)的FITC偶联抗体染色。在绿色滤光片(a)和红色滤光片(b)下观察到相同的视图。

测定了mCCCG (p8)和CVS-11的多步生长曲线，两种病毒表现出非常相似的生长动力学(图2)。mCherry作为基因组中第一个转录单位的插入并不影响基因组的转录在试管内病毒的复制。

图2. mCCCG和CVS-11的多步生长曲线。以0.01的MOI接种BHK细胞。

使用不同病毒传代的全基因组测序来评估病毒拯救和连续传代后突变累积的可能性(表S2)并且仅注意到微小的变化(表S3).正如所料，每次传代后序列多样性略有增加(表S4).

为了评估处理该病毒的安全性和其他应用的潜力，对该病毒的致病性进行了评估体内。接种CVS-11的所有小鼠(8/8)在接种后第6天显示出狂犬病的迹象。对于接种mCCCG的小鼠，7/8在接种后第10天表现出狂犬病症状。所有人都在出现临床症状后被安乐死。mCCCG组中的一只小鼠完全健康，直到实验结束(接种后第22天，补充文件S2.3，图S3).

3.2. NTmCV和FAVN的比较

家畜血清用于评估NTmCV在中和试验(S2.4)中的效用，结果如所示表S5。从两种方法获得的倒易滴度值表现出很强的相关性(R = 0.98，图3a)。再者，a Bland and Altman plot(图3b)证明了两种测试之间的高度一致性。因为血清样品以1∶3的血清稀释成四份，并且滴度值为对数3转换后，一(1)的差异相当于测试结果中四(4)口井的差异。大多数样品(63%)在两次测试之间没有差异，86%的样品显示差异少于两个孔，98%的样品差异少于四个孔。这些变化水平与仅使用FAVN的重复测量没有区别。值得注意的是，这些差异在具有高滴度的样品中最为明显(图3)，其中准确性不太重要。

图3. 使用FAVN和NTmCV测定的血清滴度值之间的相关性(a，Pearson相关性，r)和一致性(b，Bland-Altman图)。血清滴度的倒数用对数转换；Log₃ 因为进行了1∶3的连续稀释。在b中，中间的虚线表示偏差(0.03)，即。，每个数据点的FAVN滴度和NTmCV滴度之间差异的平均值。0.5 IU/ml落在对数附近32.5-3的。上面的(在0.97处)和下面的(在-1.04处)虚线代表95%置信区间的边界。

对低滴度值样品的进一步分析表明，NTmCV比FAVN稍微更敏感，因为12个由FAVN测定的值< 0.5 IU/ml的样品等于由NTmCV测定的0.5 IU/ml。当这些样本被归类为低于截止值时，与FAVN相比，NTmCV给出了98%的灵敏度和特异性。

3.3. 结果生成的自动化流程

在定义了用于区分受感染和未受感染的孔的参数之后，将从人工操作员平板读数和使用Cytation 5的自动平板读数获得的结果进行比较，以评估一致性。病毒滴定、阴性狂犬病狗血清和WOAH (0.5 IU/ml)狂犬病参考狗血清样品和10份测试样品(补充文件S2.5和表S6).

4. 讨论

抗体滴度的血清学测试对于人类接种疫苗后的评估和使宠物能够在宠物旅行计划运作的区域。目前的血清学试验是耗时的，并且依赖于FITC结合的抗体与存在于受感染细胞内的病毒核蛋白抗原的结合来观察病毒。在本研究中，在3’末端插入mCherry基因使得能够直接观察未中和的病毒(图S1和S2)消除了对丙酮固定、FITC染色、洗涤和干燥步骤的需要(图S4)。此外，它排除了任何潜在的供应问题，以及出于质量保证目的而不断测试新批次共轭剂的要求。重要的是，在资源有限的情况下，不需要购买昂贵的抗体偶联物。

荧光蛋白基因作为第一转录单位的定位对于确保其最大表达是重要的。有人担心将编码mCherry的基因放在N基因之前会影响病毒的生长。然而，表达mCherry的mCCCG病毒显示在试管内与mCCCG旨在取代的CVS-11病毒的生长动力学难以区分。遗传骨架的来源是狂犬病病毒的疫苗株(即。SAD B-19)可能促进了这种可比的增长。此外，mCherry的早期强表达充满了整个细胞，而N蛋白仅形成小的核周聚集物。这使得观察感染细胞变得容易，从而增加了病毒的表观滴度。

对拯救的病毒相对于产生它的DNA的遗传序列多样性的评估证明了基因组的稳定性，在多次传代后只有微小的变化(参见表S3和S4)。由于lyssavirus聚合酶复合物具有高错误率(~ 10 %，所以来自连续传代病毒的RNA内突变的观察是预期的-4)。适应细胞培养的遗传决定因素和蛋白质编码区和非翻译区改变的影响知之甚少，准种和有缺陷的干扰粒子在细胞培养中长期传代。需要进一步的研究来了解这些基因变化及其对病毒行为的影响。

对照现有的FAVN对NTmCV的评估表明血清学输出(表1以及S5，图3a和b)。值得注意的是，在宠物旅行和人类接触的情况下，确定对疫苗接种的满意免疫反应的可接受阈值被设定为0.5 IU/ml。因此，这个截止值附近的值的精度是至关重要的。发现NTmCV在检测低滴度值样品时比FAVN稍敏感；因此，与FAVN相比，对截止值的微小调整使我们能够实现98%的灵敏度和98%的特异性(表1，S5和图3a和b)。这种增加的灵敏度可能是由于人眼更容易阅读麦克亨利的事实。

表1. 测试的灵敏度和特异性。

灵敏度= 98%；特异性=98%，相当于使用FAVN的重复测试

尽管使用荧光病毒改进中和试验的概念并不新颖，但在以前的工作中，在G或通过将GFP与P，荧光信号较弱。为了克服这一限制，本研究证明了使用NTmCV来测定抗狂犬病病毒的抗体水平是可行的。此外，由于病毒表达红色荧光蛋白，如果需要，仍可使用市售FITC偶联抗体进行后续染色

测量中和抗体的另一种方法是使用假型病毒。假型病毒有时比真型病毒更受欢迎，因为它们被认为是安全的，而且它们被放在低封闭设施中。已经开发了各种假型方法来测量抗狂犬病病毒的抗体，使用HIV或VSV作为骨架。然而，假型病毒的生产带来了挑战，包括转染细胞系的费力和昂贵的过程，经常导致假型病毒的低和不一致的滴度。虽然使用全长high亚型载体可以获得高滴度的假病毒，一些包膜假型病毒制剂与低水平的复制活性病毒相关，需要与真正的病毒以相同的生物安全水平处理。相比之下，荧光标记的mCCCG病毒可以类似于常规病毒进行繁殖，与假型病毒相比，显著简化了高质量病毒原种的生产。

此外，我们的发现表明，mCherry荧光团可以通过自动图像阅读器、Cytation 5或潜在的能够检测MC herry/红色荧光的任何其他成像系统有效地检测。虽然我们目前的机器能够产生非常精确的结果，但其运行速度落后于熟练的人工操作员。然而，随着技术的进步，我们预计处理速度和数据输入的自动化将会提高。通过将这种病毒整合到中和分析中，这些发展具有显著节约资源的潜力，需要最少的人工干预并减少相关的错误。

mCCCG病毒对小鼠仍然是致命的，尽管它比CVS-11需要更长的时间来显示疾病的迹象，并且一只小鼠存活到实验结束(补充文件S2.3)。因此，所有涉及这种病毒的工作仍然需要在与CVS-11相同的控制水平下进行。

除了其在血清学评估中的明显价值，mCCCG还在研究两者中的病毒传播方面具有重要的潜力在试管内和在活生物体内设置。此外，它可以作为评估新型抗病毒药物和分子的功效的有价值的工具。

总之，NTmCV简化了检测程序，消除了对标记结合物的要求，这是在狂犬病流行区建立血清中和试验的一个关键障碍。不需要固定和染色允许实时评估中和输出，并减少周转时间，使其成为CVS-11病毒和FAVN检测的经济有效的替代方法。

Wu G， Lorraine MM， Goharriz H， Amaya-Cuesta J， Fooks AR， Banyard AC. A simplified method for measuring neutralising antibodies against rabies virus. J Virol Methods. 2023 Jun 28:114769. doi: 10.1016/j.jviromet.2023.114769. Epub ahead of print. PMID: 37391076.