编码保守的非刺突抗原的T细胞定向疫苗BNT162b4保护动物免受严重的新型冠状病毒感染

突出

· •BNT162b4编码新型冠状病毒N、M和ORF1ab抗原的保守免疫原性片段

· •质谱检测结合不同HLA-I等位基因的BNT162b4编码肽

· •BNT162b4在小鼠中引发非尖峰T细胞反应，同时保持尖峰免疫

· •BNT162b4通过BNT162b2保护动物免受严重疾病并增强病毒清除

摘要

T细胞反应在保护免受包括新型冠状病毒在内的β冠状病毒感染中发挥着重要作用，在这种情况下，T细胞反应与降低新冠肺炎病的严重程度和持续时间有关。为了增强新型冠状病毒变异体中不常改变的表位的T细胞免疫，我们设计了BNT162b4，这是一种mRNA疫苗成分，旨在与BNT162b2(刺突蛋白编码疫苗)结合。BNT162b4编码新型冠状病毒核衣壳、膜和ORF1ab蛋白的变异保守的免疫原性片段，靶向不同的HLA等位基因。在动物模型中，BNT162b4引发多功能CD4+和CD8+T细胞，单独或与BNT162b2共同给药时，对不同表位的反应，同时保持刺突特异性免疫。重要的是，我们证明了BNT162b4保护仓鼠免于严重疾病，并在病毒变体攻击后降低病毒滴度。这些数据表明，BNT162b2和BNT162b4的组合可以降低由循环或未来变异引起的新冠肺炎病的严重程度和持续时间。BNT162b4目前正在与BA.4/BA.5 Omicron-updated二价BNT162b2 (NCT05541861)联合进行临床评估。

关键词

· 新型冠状病毒

· 新冠肺炎（新型冠状病毒肺炎）

· 病毒变体

· mRNA T细胞疫苗

· 疫苗设计

· HLA配体组学

· T细胞反应

· 免疫防护

1.介绍

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)，一种新的β-冠状病毒，属于sarbecovirus家族，是一种高度传播和致病的呼吸道病毒，引起新冠肺炎疫情。编码SARS-Cov-2刺突蛋白(负责病毒进入细胞)的疫苗已被用作缓解新冠肺炎疫情的关键干预措施。最近，出现了高度传染性的新型冠状病毒变种，如Omicron及其亚系，其中一些可以逃避疫苗接种或先前暴露产生的中和抗体。虽然目前批准的编码S蛋白的疫苗仍然可以通过抗体和细胞介导的机制有效地防止严重疾病，但利用对保守抗原的细胞免疫可以提供更强的保护，防止由循环和未来变异引起的严重疾病。

两种CD4+和CD8+T细胞已经证明反应在控制和清除β冠状病毒中是重要的。通常，在识别主要组织相容性复合体(MHC)II类分子上的同源表位后，CD4+T细胞通过分泌细胞因子和趋化因子帮助协调对感染的整体免疫反应，并支持B细胞产生抗体，以及其他免疫细胞的细胞毒性功能。CD8+T细胞可以通过MHC类分子在宿主细胞表面呈递的表位识别病原体感染的细胞。一旦检测到受感染的细胞，CD8+T细胞发挥细胞毒性功能，导致被感染细胞的消除，并限制宿主内病原体的传播。在被与新型冠状病毒密切相关的SARS-CoV感染后，中和抗体水平随时间而下降，而病毒特异性T细胞记忆会在十年后的恢复期患者中持续存在。最近的一项研究报道，核衣壳(N)特异性T细胞在SARS-CoV感染后持续存在17年，突出了针对新型冠状病毒的持久T细胞应答的潜力。功能上，CD8+T细胞的减少新型冠状病毒康复期非人灵长类动物的降低了天然免疫对再次攻击的保护作用，证明了细胞免疫反应的重要性，尤其是在低基线抗体滴度的情况下。CD8+T细胞的消耗针对新型冠状病毒S和/或N蛋白免疫接种后的也消除了对动物模型中随后攻击的保护，显示了它们在疫苗接种环境中的重要性。在人类中，mRNA刺突编码疫苗BNT162b2诱导了持久的T细胞反应。在疫苗接种后的突破性感染中，T细胞活化与病毒清除率呈正相关，与病毒滴度的峰值呈负相关。最近，据报道，疫苗接种后的突破性病例与S特异性T细胞反应降低有关；在缺乏变异反应性T细胞的情况下，突破性感染的机会更高。然而，疫苗诱导的T细胞在人体中的确切作用、机制和贡献仍有待阐明。此外，疫苗特异性数据集中于S特异性T细胞反应，这可能不同于针对其他病毒抗原的T细胞反应。

重要的是，在新冠肺炎疫情期间对人类样本的研究表明，新型冠状病毒特异性T细胞可能对严重的新冠肺炎提供持久的免疫力，并与缩短的病程有关。感染或疫苗接种后的新型冠状病毒特异性T细胞反应通常比抗体反应更早被检测到。快速的细胞反应与感染后疾病严重程度的降低相关，通过接种编码S蛋白的BNT162b2疫苗诱导的S特异性T细胞反应与这种新冠肺炎疫苗的效力相关。此外，CD8+T细胞的增加具有受损B细胞区室的血液肿瘤患者的与新型冠状病毒感染后存活率增加相关。总之，证据表明细胞介导的免疫反应在控制新型冠状病毒病毒中的重要性和持久性，这可以进一步用于疫苗开发。

最近的研究表明，N蛋白、膜蛋白(M)和开放阅读框1ab (ORF1ab)多蛋白是最具T细胞免疫原性的新型冠状病毒抗原。此外，正在探索多抗原疫苗的好处。一项研究表明，记忆性T细胞反应比抗体产生激活得更快，可以通过识别ORF1ab表位后快速清除病毒来提供显著的保护。T细胞表位优于中和抗体表位的一个显著优势是它们在新型冠状病毒变异体中的保守性。虽然暴露于给定新型冠状病毒变体的不同个体的抗体汇聚在一小组相似的中和表位上，但是由于个体之间的特异性人类白细胞抗原(HLA)单倍型，T细胞表位在个体之间是多样化的，这为病毒逃避T细胞免疫提供了进一步的障碍。

为了将T细胞反应扩展到S蛋白以外，我们开发了BNT162b4，这是一种mRNA疫苗成分，旨在增强细胞对新型冠状病毒的免疫力。BNT162b4编码新型冠状病毒N、M和ORF1ab蛋白的片段，旨在与编码S蛋白的疫苗(如BNT162b2)一起施用。在这里，我们表明BNT162b4产生了人类细胞系中HLA-I复合物上的T细胞表位，可通过质谱(MS)检测。当单独施用或与编码S蛋白的BNT162b2联合施用时，用BNT162b4免疫小鼠产生针对N、M和ORF1ab新型冠状病毒蛋白的强有力的T细胞应答。最后，我们证明BNT162b4在用各种新型冠状病毒变体攻击后保护仓鼠免于严重的新冠肺炎，并且当与BNT162b2配对时，增强针对新型冠状病毒的免疫力。BNT162b4目前正在与BA.4/BA.5 Omicron-updated二价BNT162b2 (NCT05541861)联合进行临床评估。

2.结果

2.1BNT162b4疫苗设计和跨新型冠状病毒变异体的抗原保守性

BNT162b4是在2020年9月，在显著的新型冠状病毒变异体出现之前合理设计的，以最大限度地提高不同人群的T细胞免疫原性。基于当时报道的新型冠状病毒恢复期患者的免疫原性和预测的免疫原性和来自感染细胞的蛋白质表达数据，我们从ORF1ab中选择了N、M和非结构蛋白(NSP)1–4，用于T细胞靶向疫苗成分(图 1A; Table S1)。对于N和M蛋白，选择富含报道的和预测的CD8+和CD4+ T细胞表位的片段(图1b–1F；表S2-S3)。对于ORF1ab，由于其长度(> 7000个氨基酸)，我们采用了不同的方法，使用了大量较短的片段，这些片段包含来自编码NSPs 1–4的整个基因组区域的最小HLA-I靶向表位。NSPs 1-4被特别选择，因为它们是病毒感染后合成的第一个蛋白质，并且它们比其他ORF1ab NSPs含量更高。从这四个NSP中，仅考虑预测的表位，这些表位以前也被证明是免疫原性的(大约在2020年9月)，18个9-16个氨基酸的序列片段被选入BNT162b4(图11H；图S1; 表S1)。总之，BNT162b4包含105个HLA-I等位基因中的2257个唯一预测的肽-HLA-I对和70个HLA-II等位基因中的1992个唯一预测的肽-HLA-II对(表S2-S3)。预计被选择包含在疫苗中的每个抗原片段都含有受HLA-I等位基因限制的表位，这些等位基因存在于99%或更多的全球人群中。

图1BNT162b4的抗原选择和设计。

(A)BNT162b4的示意图，包含新型冠状病毒N(绿色)和M蛋白(蓝色)的高免疫原性片段，以及包含来自orf 1 ab NSPs 1–4(灰绿色)的最小表位的短片段。

(B)大约在2020年9月和2022年12月的同期文献中报道的表位计数。看见星形方法参考部分。

(C–G)预测的表位呈递，来自Poran等人，2020。(H)在大约2020年9月的同期文献中报道的ORF1ab NSP1的免疫原性区域。对于图(C )-( H )，线条代表沿着病毒蛋白质的每个残基处独特的肽-HLA对的数量，阴影区域代表完全包含在BNT162b4中的区段内的独特的肽-HLA对的数量。

(I)概述了来自过去和目前流行的变体的S蛋白(上图)和BNT162b4(下图)中的非同义突变的示意图。BNT162b4表示氨基酸取代。蛋白质的长度是成比例的。SP，信号肽；S1-NTD，S蛋白S1亚单位的N-末端结构域；RBD，受体结合域；S1-CTD，S蛋白S1亚单位的C-末端结构域；S2，S蛋白的S2亚单位；跨膜结构域。变体突变列表可从以下网站获取:世卫组织， 协变量， 覆盖谱系，或者BV-BRC.

为了研究BNT162b4是否会受到替代祖先新型冠状病毒毒株的变异体的影响，我们将世界卫生组织(WHO)(截至2022年12月)认可的变异体中存在的突变绘制到BNT162b4上。与S蛋白相比，BNT162b4在一些Omicron变体(如XBB)中包含超过40个非同义突变，其中大多数集中在受体结合结构域(RBD)，在这些变体中仅包含4个非同义突变，截至2022年12月，仅两个非同义突变来自循环Omicron变体(图1)。

2.2质谱HLA配体组学分析鉴定BNT162b4衍生的HLA呈递表位

为了检测BNT162b4是否能产生T细胞表位，这些表位被加工并呈递到HLA复合物上，我们使用靶向质谱检测BNT162b4与HLA-I分子结合的肽。为了准确确定表位与哪个HLA等位基因结合，我们使用标记等位基因构建体的单等位基因谱(MAPTAC)从A375细胞系中存在的内源性HLA等位基因的背景中外源性表达和分离单个HLA等位基因，以及靶向内源性A∗02:01的BB7.2抗体和泛HLA-I抗体W6/32，以分析与其他A375内源性等位基因(A∗01:01， B∗44:03， C∗16:01)结合的表位。从BNT162b4中预测与测试的HLA等位基因结合的序列生成用于靶向MS分析的肽列表或由Weingarten-Gabbay等人的MS观察到。总之，我们在7个HLA等位基因上鉴定了19个独特的肽表位，并观察到30个独特的肽-HLA对。验证的肽跨越BNT162b4的整个长度，并且检测到来自所有三种编码的病毒抗原的肽(图2; 表1)。值得注意的是，所有19个MS验证的表位先前都被报道为免疫原性的，或者包含在先前被报道为免疫原性的肽中，其中9个在先前的研究中被认为是“免疫显性的”。此外，免疫显性ORF1ab表位PTDNYITTY和TTDPSFLGRY被合理地设计用于用可切割的接头进行加工，它们出现在几乎每一个被测试的HLA等位基因上，而不考虑预测的出现(表1; 图S2a)。本研究中的几个表位似乎是作为同一HLA等位基因上较长表位的子序列而“嵌套”的，但具有不同的色谱保留时间，表明它们不是MS分析的人工产物(图S2b)。从第一个M区段中没有检测到表位，可能是由于来自该序列的肽更疏水。因此更具挑战性的是从样品处理中恢复并通过MS用这里采用的方法进行检测(图S2c)。这些MS检测到的表位仅代表所有表位的一个子集，这些表位预计由本研究中未检测的HLA等位基因呈现。除了靶向MS分析，还对样本进行了数据依赖分析(DDA )，以寻找HLA复合物上存在的潜在跨连接表位。虽然DDA分析揭示了来自BNT162b4的6个表位，包括来自短ORF1ab片段的5个表位，但是没有一个观察到的表位跨越相邻片段之间的连接(表1; 表S4)。总之，这些数据表明BNT162b4 mRNA被完整翻译，产生被加工并呈递到人类HLA复合物上的表位，用于T细胞的潜在免疫识别。

图2通过质谱法直接测量，BNT162b4是HLA呈递表位的来源

(A)通过靶向质谱法检测到19个独特的BNT162b4衍生的表位，其中至少一个表位来自每种编码的新型冠状病毒抗原。

(B和C) (B)同位素编码的肽用于产生色谱图，每种颜色代表对所示肽特异的独特片段离子(箭头表示色谱峰的顶点),和(C)从头到脚的图，其证实匹配的保留时间、匹配的片段模式和仅对BNT162b4转染的样品的特异性(显示的是表位# 18:A上的ORF1ab PTDNYITTY∗01:01)。表位序列和等位基因限制可以在表1。其他色谱图、从头到脚的图和完整的DDA结果可在原始数据存储库中找到(参见数据和代码可用性)。

表1通过质谱法检测的BNT162b4中编码的表位

a 仅在pan-HLA-I W6/32下拉序列中观察到表位，等位基因从具有A375 HLA等位基因的序列预测中推断。表位编号映射到图2A.

b 在相应等位基因的靶向和发现模式MS分析中都观察到表位。

图S2 BNT162b4是通过质谱法直接测量的HLA呈递表位的来源，与图2

(A)免疫显性ORF1ab表位PTDYNYITTY和TTDPSFLGRY的色谱图，观察到其存在于本研究中测试的所有等位基因上(除A∗11:01)。每种颜色代表特定于所示肽的独特碎片离子。箭头表示色谱峰的顶点。(B)表位肽与嵌套序列的保留时间比较。(C) BNT162b4覆盖有MS观察到的表位和Kyte-Doolittle亲水性评分。评分范围从4.5(更亲水)到4.5(更疏水)。

BNT162b4在小鼠模型中诱导CD4+和CD8+ T细胞应答

BNT162b4的免疫原性在几个不同的鼠模型中以单剂量或双剂量设置进行了研究。HLA-A2.1转基因小鼠，其表达能够与小鼠CD8+相互作用的嵌合人类HLA-A∗02:01，用剂量滴定的脂质纳米粒包封的mRNA进行免疫，并使用interferon-ɣ(ifn-ɣ)-specific elispot和流式细胞术(ICS)进行细胞内染色)分析t细胞反应(图3)。在用n或m肽库刺激后，用3 μg或1.5μg bnt 162 b 4处理的组的脾细胞显示出明显高于载体对照脾细胞的IFN-ɣ斑点计数。接种两次疫苗的所有治疗组的平均斑点计数高于接种一次疫苗的小鼠(图3B和3C)。值得注意的是，尽管在BNT162b4中所包含的18个ORF1ab表位中只有3个被预测为结合HLA-a∫02:01，但是在最高剂量群组中的任一时间点，用ORF1ab肽库刺激的脾细胞都表现出比载体对照显著更高的IFN-ɣ水平(图3B和3C)。两种CD4+和CD8+T细胞表现出激活标记、细胞因子反应和脱粒标记的上调，表明通过表达以下三种或多种物质具有多功能性和细胞毒性潜力:IFN-ɣ、TNF-α、IL-2或CD107a(图3d和3E)。对来自肽脉冲的脾细胞的上清液的中尺度发现(MSD)分析表明了强烈的Th1细胞因子应答，如免疫小鼠中低水平的IL-4和高水平的IFN-ɣ、TNF-α和IL-2所示(数字S3a和S3B)。BNT162b4的免疫原性也在K18-hACE2 C57BL/6J (H2kb)转基因模型，以及BALB/c小鼠模型(H2kd)，以强调不同的多个MHC等位基因(数字S4和表面抗原-5，分别为)。综上所述，这些数据表明BNT162b4可以在具有不同MHC背景的多种动物模型中产生针对N、M和ORF1ab的T细胞应答，并且这些T细胞的表型与先前关于BNT162b2诱导的T细胞应答的报道一致。

图3 BNT162b4的T细胞免疫原性。

(A) 免疫原性实验的示意图(n = 6只动物/组)。 (b)仅在初次免疫后第14天来自肽脉冲的脾细胞的IFN-ɣ ELISpot数据，一式三份。N蛋白库包含39个肽，M库包含22个肽，ORF1ab库包含19个肽。 (c)在两剂BNT162b2(一式三份)后第35天来自肽脉冲的脾细胞的IFN-ɣ ELISpot数据。 (D)在用M肽库脉冲的第35天脾细胞中，对CD8+ T细胞和CD4+ T细胞进行流式细胞表型分析和细胞内染色。 (E)在用N肽库脉冲的第35天脾细胞中，对CD8+ T细胞和CD4+ T细胞进行流式细胞表型分析和细胞内染色。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较后检验评估统计显著性。显示了经多重性调整的p值。 ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.01, ∗∗∗p ≤ 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001. 。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。

图S3 BNT162b4免疫的HLA-A2.1 Tg动物的细胞因子分泌模式，与图3

(A)通过电化学发光免疫测定(ECLIA)分析来自M蛋白肽脉冲的脾细胞的上清液中的Th1和Th2细胞因子水平。(B)通过电化学发光免疫测定(ECLIA)分析来自N蛋白肽脉冲的脾细胞的上清液中的Th1和Th2细胞因子水平。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较后检验评估统计显著性。显示了经多重性调整的p值。 ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.01, ∗∗∗p ≤ 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。

图S4BNT162b4在K18-hACE2 C57BL/6小鼠模型中的免疫原性，与图3

(A)免疫原性实验的示意图(n = 6只动物/组)。 (b)仅在初次免疫后第14天来自肽脉冲的脾细胞的IFN-ɣ ELISpot数据，一式三份。N蛋白库包含39个肽，M库包含22个肽，ORF1ab库包含19个肽。 (c)在两剂BNT162b2(一式三份)后第35天来自肽脉冲的脾细胞的IFN-ɣ ELISpot数据。 (D)在用M肽库脉冲的第35天脾细胞中，对CD8+ T细胞和CD4+ T细胞进行流式细胞表型分析和细胞内染色。 (E)在用N肽库脉冲的第35天脾细胞中，对CD8+ T细胞和CD4+ T细胞进行流式细胞表型分析和细胞内染色。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较后检验评估统计显著性。显示了经多重性调整的p值。 ∗p ≤ 0.05, ∗∗p ≤ 0.01, ∗∗∗p ≤ 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。

图S5 BNT162b4联合BNT162b2在BALB/c小鼠模型中的免疫原性，与图3

(A)组合免疫原性实验的示意图(每组n = 8只动物)。(B)来自免疫动物的S蛋白S1特异性IgG滴度，所有稀释均一式两份进行。(C)S1特异性IgG发育的动力学。(D)在第14天和第35天免疫动物的中和抗体滴度。(e)来自肽脉冲的脾细胞的IFN-ɣ ELISpot，用N-末端s蛋白肽库(右)或c-末端s蛋白肽库(左)脉冲，重复三次。(F)多官能CD8+(左)或CD4+(右)T细胞对S蛋白N末端(顶部)或C末端(底部)肽库具有反应性。(g)来自用n肽库(左)或m肽库(右)脉冲的肽脉冲脾细胞的IFN-ɣ ELISpot。(H)多官能CD8+(左)或CD4+(右)T细胞与N(上)或M(下)肽库反应。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较后检验评估统计显著性。显示了经多重性调整的p值。∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001。LLOD:检测下限。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。

用BNT162b4免疫维持了BNT162b2驱动的免疫反应

由于BNT162b4旨在补充编码S蛋白的BNT162b2疫苗，我们试图证实1 μg BNT162b4和1 μg BNT162b2的联合给药维持了1 μg BNT162b2单独诱导的S特异性免疫应答(图S5a)。BNT162b4与BNT162b2的组合保持了单独使用BNT162b2时观察到的高S1特异性抗体滴度(图S5b和S5C)。中和抗体滴度遵循相似的趋势，其中接受BNT162b4和BNT162b2组合的动物显示出与单独接受BNT16b2的动物相当的中和滴度(图S5d)。此外，在用BNT162b2和BNT162b4的组合免疫的动物中产生的S特异性T细胞的水平类似于用单独的BNT162b2免疫产生的水平，进一步证明了与BNT162b4的组合维持了BNT162b2免疫应答(图S5e–S5H)。值得注意的是，与单独接受BNT162b4的组相比，接受BNT162b2和BNT162b4的组中的N和M特异性反应减少，尽管在两种情况下检测到的反应都明显强于赋形剂对照(图S5g和S5H)。

BNT162b4和BNT162b2的组合在先前接种过BNT162b2的动物中证明了免疫原性

世界上很大一部分人以前通过接种疫苗或感染接触过新型冠状病毒蛋白。为了了解接种BNT162b4疫苗将如何影响这些个体对S蛋白的预先存在的免疫反应，我们试图评估在接种编码S蛋白的BNT162b2疫苗后引入BNT162b4的影响，类似于BNT162b4目前如何与BA.4/BA.5更新的二价BNT162b2 (NCT05541861)联合进行临床评估。首先用两个1 μg剂量的第一系列BNT162b2免疫的HLA-A2.1转基因小鼠随后被给予第三个剂量的载体，1 μg BNT162b4、1 μg BNT162b2或以1 μg BNT162b2和0.33 μg BNT162b4的3∶1比例分别配制的BNT162b2和BNT162b4(图4a)。

图4预先存在的BNT162b2免疫原性对联合接种BNT162b4和BNT162b2疫苗的影响

(A)示意图在活生物体内评估预先存在的S特异性免疫反应影响的实验(n = 4–8只小鼠/组)。

(B)接种后第56天的S蛋白S1特异性IgG滴度，所有稀释都是一式两份进行。

(C)整个治疗过程中的S蛋白S1-IgG动力学。

(D) 50%假病毒中和(pVN503)在第3次给药后14天收集的血清中针对新型冠状病毒野生型毒株的几何平均滴度(GMT ),显示检测下限(LLOD)。

(e)使用s蛋白肽库，用肽脉冲的脾细胞进行IFN-ɣ ELISpot T细胞反应，一式三份。

(F)多官能CD8+和CD4+使用S蛋白肽库对来自脾细胞的t细胞进行肽脉冲。

(g)来自用BNT162b4相关肽库进行肽脉冲的脾细胞的ifn-ɣelispot t t细胞反应，一式三份。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较后检验评估统计显著性。显示了经多重性调整的p值。∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。

在两剂BNT162b2后，与载体对照相比，用BNT162b4免疫对S蛋白S1 IgG滴度没有影响(图4b)。此外，总S蛋白S1 IgG水平显示，用第三剂量的共同施用的BNT162b2和BNT162b4治疗导致产生与用第三剂量的单独BNT162b2治疗相似水平的针对S1抗原的抗体(图4c)。与单独的BNT162b2相比，与BNT162b4共同施用的BNT162b2免疫，无论是作为初次接种系列还是作为BNT162b2预免疫后的第三次剂量，都显示了相似水平的中和抗体(图4d)。

ELISpot试验分析证实，无论在第三次免疫中BNT162b4是否与BNT162b2组合，T细胞对S蛋白的反应都是相似的(图4e，右)。与在第三次免疫中接受载体对照的动物相比，在第三次免疫中单独接受BNT162b4的动物表现出更高的S-特异性T细胞应答(图4e，左)。ICS分析进一步表明，与单独BNT162b2的第三次治疗相比，单独BNT162b4或与BNT162b2组合的第三次免疫在肽刺激后导致类似的多功能反应(图4f)。在第三次剂量中包含BNT162b4导致对N、M和ORF1ab区段的强T细胞反应，因此扩大了针对额外新型冠状病毒靶蛋白的T细胞反应(图4g)。

此外，在免疫的K18-hACE2小鼠中，在给予BNT162b4的动物的外周血中看到的S-特异性T细胞表现出与单独给予BNT162b2的动物相似的频率，表明S-特异性T细胞的发育没有受到影响(图S6).与单独给予BNT162b2的动物相比，单独给予第三剂BNT162b4或与BNT162b2联合给予第三剂bnt 162 b 4的动物中的s-特异性T细胞显示出稍高的早期记忆表型发生率(图S6h)。总的来说，第三剂BNT162b4单独免疫或与BNT162b2联合免疫可维持S特异性免疫，并诱导更广泛的疫苗诱导的T细胞，包括对N、M和ORF1ab抗原的应答。

图S6在K18-hACE2小鼠中，预先存在的BNT162b2免疫对与BNT162b2联合施用的BNT162b4疫苗接种的影响，与图4

(A)示意图在活生物体内评估预先存在的BNT162b2免疫反应的影响的实验(每组n = 6只动物)。(B)治疗后第56天的S蛋白S1特异性IgG滴度，所有稀释都重复进行。(C)整个治疗过程中的S蛋白S1-IgG动力学。(D)在第56天使用pVNT试验中和免疫动物的滴度。(e)使用s蛋白肽库，用肽脉冲的脾细胞进行ifn-ɣelispot t-细胞反应，一式三份。(F)外周血中S特异性T细胞的多聚体染色。(g)来自用BNT162b4相关肽库进行肽脉冲的脾细胞的ifn-ɣelispot t t细胞反应。(H)引流淋巴结中S特异性T细胞的记忆表型。车辆组在总CD8上门控+t细胞。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较后检验评估统计显著性。显示了经多重性调整的p值。∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。

BNT162b4免疫小鼠的T细胞受体库和表型分析

我们试图通过单细胞RNA测序更好地了解包含BNT162b4对S特异性T细胞表型和T细胞受体(TCR)库的影响。HLA-A2.1 Tg动物用两个剂量的第一系列BNT162b2免疫以产生S-特异性免疫，然后用后续剂量的单独BNT162b2或BNT162b2和BNT162b4的组合免疫，如中所述图4A.s特异性CD8+使用装载有三个高免疫原性S蛋白表位的MHC四聚体从多种动物的脾细胞中富集T细胞(图5a)。分离来自T细胞的核酸并用于产生转录组和表位的VDJ细胞索引(CITE)研究包含BNT162b4对T细胞克隆性、扩增和功能表型的影响的文库(图5a和5B)。

图5BNT162b4对S特异性TCR库和T细胞表型的影响

(A)产生免疫动物(n = 4只动物/组)的S特异性T细胞的GEX、CITE和VDJ文库的单细胞RNA测序实验的示意图。

(B)使用MHC四聚体的多模态scRNA-seq的S特异性T细胞的流动分选门控的代表性图。

(C)来自动物的最大克隆(≥5个细胞)的克隆型网络，所述动物用三种剂量的BNT162b2或两种剂量的BNT162b2然后是一种剂量的联合BNT162b2和BNT162b4免疫。每个圆圈代表一个独特的CDR3克隆(阿尔法/贝塔都考虑)；圆圈大小代表具有相应TCR克隆的细胞数量；连接的圆圈代表具有相似CDR3序列的克隆型集群。66

(D)每个处理组中属于包含1、2、3或≥4个细胞的克隆的独特T细胞的数量。

(E)来自分选的T细胞的单细胞转录组的UMAP图，通过聚类分配(顶部)或实验组(底部)着色。

(F)所选记忆和激活标记的CITE-seq分析的标准化和比例化的细胞表面表达。

(G)聚类的最高差异表达(通过t检验分数分类)基因的热图。色标表示组中的平均表达。

(H)来自每个处理组的细胞的簇组成。

(I)差异富集基因组的基因组富集分析，比较免疫动物与对照动物，以及单独用BNT162b2免疫的组与用BNT162b2和BNT162b4的组合免疫的组之间的差异富集基因组。色标表示标准化富集分数(NES)。

VDJ序列的分析表明，与仅用BNT162b2免疫的动物相比，用BNT162b4与BNT162b2联合免疫的动物表现出经历S特异性T细胞克隆扩增的克隆数量的统计学显著增加(图5c和5D，通过对相同数量的随机二次抽样细胞进行卡方检验评估，在100次独立抽样中p值< 4.83e-7)。为了检查细胞表型，将莱顿聚类算法应用于基因表达谱(图5e)。基因表达数据强调了用BNT162b4和BNT162b2免疫导致T细胞的活化和记忆簇，类似于单独用BNT162b2免疫(图5e–5G)。此外，CITE分析显示两组均含有记忆细胞簇，如CCR7、CD62L和CD27等记忆标记的存在所证明，以及活跃扩增的T细胞簇，如PD1、CD44和KLRG1的上调所证明(图5f)。我们评估了关于来源样品的每个簇的组成:载体，单独用BNT162b2的第三次免疫，或用BNT162b2和BNT162b4两者的第三次免疫。来自免疫动物的细胞类似地分布在群集(尤其是群集0、1、3和5)中，与未免疫动物的群集明显不同(群集2、4和6；图5h)。基因集合富集分析强调用BNT162b4和BNT162b2的组合免疫的动物显示出与用单独的BNT162b2免疫的动物高度相似(图5我)。总之，这些数据表明，当单独施用BNT162b2或与BNT162b4一起施用时，S特异性T细胞的表型和功能得以保持。

BNT162b4赋予金色叙利亚仓鼠抵抗病毒攻击的保护性免疫

为了确定来自BNT162b4的T细胞免疫原性是否可以导致对严重新型冠状病毒感染的保护，我们用两种剂量的9 μg或4.5 μg单独的BNT162b4或以不同比例与BNT162b2组合免疫金色叙利亚仓鼠。在最后一次免疫接种后两周，对动物进行野生型新型冠状病毒病毒株USA-WA1/2020的鼻内接种，并通过体重减轻、病毒滴度和收获时肺中的组织病理学来测量疾病的严重程度(图6一个和正常人血清中的一种蛋白质成分)。用BNT162b2免疫导致对野生型新型冠状病毒病毒株的保护，如体重减轻的缺乏和存在于肺和鼻甲中的可忽略的病毒滴度(图6b和6C)。用BNT162b2和BNT162b4的组合免疫的动物也被保护免受病毒攻击，如在肺和鼻甲中可忽略的病毒滴度所见(图6b和6C)。单独的BNT162b4免疫也以剂量依赖的方式产生对抗攻击的显著保护作用，如与赋形剂对照相比较低程度的体重减轻所表明(图6b)。当与未免疫的动物相比时，来自单独用BNT162b4免疫的动物的肺和鼻甲中的病毒滴度也较低，证明T细胞在限制疾病的严重性中起作用(图6b)。与单独用BNT16b2免疫的动物相比，用BNT162b2和BNT162b4的组合免疫的动物在鼻甲中显示出较低的病毒滴度，表明更广泛的T细胞反应可以改善上呼吸道中的保护(图6c)。感染后7天动物的肺病理学分析进一步支持了病毒肺滴度分析的结果。用BNT162b2单独免疫或与BNT162b4联合免疫的动物显示出对新型冠状病毒感染相关的炎症、增生和水肿(图S7)。与未免疫的动物相比，单独用较高剂量的BNT162b4免疫导致显微镜检查结果的严重性降低(图S7)。

图6BNT162b4赋予金色叙利亚仓鼠模型保护性免疫

(一)示意图在活生物体内金色叙利亚仓鼠的功效模型(n = 10只动物/组)。

(B)在免疫动物中用WT新型冠状病毒攻击后的体重变化。

(C)来自肺匀浆和鼻甲匀浆的TCID50病毒滴度，感染后第2天，一式四份测量。

(D)按照(A)中的实验方案，用δ新型冠状病毒毒株攻击免疫动物后的体重变化。

(E)来自肺匀浆和鼻甲匀浆的TCID50病毒滴度，感染后第2天，来自用δ新型冠状病毒毒株攻击的每组的一半。

(F)按照(A)中的实验方案，在免疫动物中用Omicron BA.1新型冠状病毒株攻击后的体重变化。

(G)来自用Omicron BA.1新型冠状病毒株攻击的半数群体的感染后第2天的肺匀浆和鼻甲匀浆的TCID50病毒滴度，一式四份测量。

采用单因素方差分析和Dunnett多重比较后检验评估统计显著性。显示了经多重性调整的p值。∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001。LLOD，检测下限。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。请参见图S7.

图S7野生型新型冠状病毒攻击后金色叙利亚仓鼠的肺部病理，涉及图6

感染后7天野生型SARS-CoV2感染动物肺的H&E染色:1.3倍放大(A)和10倍放大(B)。与新型冠状病毒相关的显微镜检查结果的特征是深色染色的实变区域；由于福尔马林膨胀不良，第2组和第5组中被感知为黑暗的任何区域被认为是人工气道塌陷。对感染后7天的受感染动物的肺组织进行组织病理学评分，包括(C)炎症、(D)增生和(E)水肿。基于每只动物在每个区域中的发现的百分比来确定分数，该分数基于以下评分:0-无病理变化；1–最小< 10%受影响区域；2–轻度10–25%区域，3–中度25–50%区域，4–标记50–95%区域。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较后检验评估统计显著性。显示了经多重性调整的p值。∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p < 0.0001。误差线表示平均值的标准误差(SEM)。

为了研究BNT162b4对针对病毒变体的保护作用的影响，用BNT162b2、BNT162b4或它们的组合免疫仓鼠，并用鼻内接种表现出人类严重病理的高传染性δ变体进行攻击和仓鼠 (图6d和6E)或高度突变的Omicron BA.1变体(图6f和6G)。这些数据证明了用Delta变体或Omicron BA.1变体攻击后对体重减轻的保护作用。在用BNT162b2和BNT162b4的组合免疫的动物中，用δ变体攻击后肺和鼻甲中的病毒滴度显著降低(图6e)与单独用BNT162b2免疫的动物相比。与肺相比，用两种疫苗的组合进行免疫所带来的益处在鼻甲骨中更显著，这与在野生型(WT)病毒攻击后所看到的相似。与Delta和WT攻击相比，Omicron BA.1变体的攻击表现出较低的致病性，如前所述，其表现为较不严重的体重减轻和较低的总病毒滴度。在Omicron BA.1攻击后，无论是用BNT162b2、BNT162b4还是它们的组合进行免疫，所有动物都表现出肺部病毒负荷降低，并且在Omicron攻击后，各组间鼻甲病毒滴度的差异不太显著(图6g)。综合来看，这些数据表明，BNT162b4提高的免疫力可以预防多种新型冠状病毒病毒变异体引起的症状，并且与变异体适应的BNT162b2结合，可以降低未来变异体在接种个体中引起严重疾病的可能性。

讨论

编码刺突蛋白的mRNA疫苗对大多数显性新型冠状病毒变异体引起的疾病非常有效。然而，随着时间的推移，中和抗体滴度的下降以及抗原性独特的S蛋白的增加导致突破性感染的增加，这需要疫苗来提供对新出现的新型冠状病毒变异体和相关疾病的更持久的免疫力。最近的研究表明，细胞免疫受病毒变异体的影响要小得多，而强有力的、多样的细胞免疫反应可能会抵消不太有效的中和抗体滴度。此外，针对各种病毒模型的几项研究强调了T细胞反应在限制病毒复制和负载方面的重要性通过清除病毒感染的细胞。因此，在不断变化的病毒环境中，在疫苗中加入额外的T细胞抗原经常被认为可以提高免疫反应的效力和持久性。

与抗体靶不同，T细胞抗原不限于细胞外蛋白，因此许多非S抗原是潜在T细胞表位的丰富来源。为了开发一种具有多个保守T细胞表位的mRNA编码疫苗成分，可以普遍用于对抗所有常见的新型冠状病毒变异体，我们将我们的方法集中在免疫原性新型冠状病毒抗原的保守片段上。我们设计并评估了BNT162b4，它是一种mRNA疫苗成分，编码N蛋白、M蛋白的高免疫原性片段，以及包含来自ORF1ab多蛋白的最小表位的短片段。

使用靶向质谱，我们显示BNT162b4从所有三种编码抗原产生T细胞表位，这些抗原存在于广泛的HLA等位基因上。将不同病毒抗原的片段串联起来，可能会产生新型冠状病毒蛋白质组中不存在的连接表位。通过包含预期增强切割的一小段氨基酸，我们的目标是增加从多蛋白中加工出所需表位的机会，并降低连接肽产生的可能性。DDA MS没有检测到连接区表位，而我们的HLA配体组学分析频繁检测到连接区相邻的ORF1ab表位，这支持了这一点，表明在这些位点存在有效的切割。

在活生物体内，BNT162b4在多种小鼠模型中产生针对三种抗原的强大的多功能T细胞应答。BNT162b4和BNT162b2的组合扩大了抗原特异性T细胞库，但不会负面影响BNT162b2诱导的针对S蛋白的中和抗体反应。类似地，BNT162b4与BNT162b2共同给药不会损害BNT162b2诱导的S特异性T细胞的所有功能、频率和功能表型。然而，与单独使用BNT162b4相比，当BNT162b4与BNT162b2联合使用时，检测到N-和M-特异性T细胞中细胞因子分泌减少。这可能表明对S蛋白的反应与对N和M蛋白的反应之间存在竞争。虽然确切的原因尚不清楚，但它可能是由于表位丰度和BNT162b2与BNT162b4表位的差异或S特异性T细胞的免疫优势引起的。重要的是要注意，尽管有这种潜在的干扰，BNT162b4扩大了T细胞对额外新型冠状病毒抗原的总反应。

最重要的是，我们发现在新型冠状病毒仓鼠攻击模型中，BNT162b4诱导的免疫降低了各种病毒变异体的疾病严重程度。将BNT162b2与BNT162b4组合增强了针对病毒攻击的保护，并且当仓鼠被以更严重的疾病病理学为特征的δ变体攻击时，这种额外的益处被最清楚地证明。通过相关性和临床前实验的几项研究表明，病毒特异性T细胞具有直接预防严重疾病的能力。在这里，我们直接证明了T细胞靶向疫苗成分BNT162b4的添加进一步增强了两者组合时由BNT162b2赋予的免疫保护，这通过在用多种新型冠状病毒变体攻击的动物中观察到的较低的病毒滴度、改善的肺病理学和体重减轻来测量。有趣的是，当动物受到野生型毒株或Delta变体的攻击时，BNT162b4驱动的免疫反应提供了保护，这似乎对鼻甲特别有影响，这潜在地表明了粘膜免疫增加的作用，其中IgG的可及性有限，提供的保护较少。当用Omicron BA.1变体攻击动物时，未检测到病毒滴度降低可能是由于该变体的总体病毒负荷较低或与Omicron毒株相关的炎症反应较低。通过添加BNT162b4在上呼吸道中提供的保护，无论是通过组织驻留记忆T细胞的存在还是感染时T细胞的迁移，都是特别有吸引力的，因为这可能表明降低的传播率的可能性。这种现象类似于一项研究，该研究表明，T细胞对ORF1ab多蛋白的反应可能导致更多的流产感染，这可能是通过靶向早期感染细胞实现的。感染后迅速激活的有效记忆T细胞反应可能意味着宿主内病毒传播和免疫逃避机制激活的时间更少。

虽然有证据表明T细胞反应在控制新型冠状病毒感染中的重要性，但专注于提高T细胞反应的疫苗如何在临床环境中帮助预防新冠肺炎仍是未知的。在使用mRNA S蛋白编码疫苗的研究中，T细胞对突变变异表位的反应基本保持完整；然而，疫苗控制感染的能力取决于受试者对感染变异体的中和抗体水平。在猕猴模型中也报道了这一点，其中动物针对β变体的中和滴度水平降低，从而降低了对感染的控制，即使T细胞反应得以保留。此外，监测多次疫苗接种后T细胞应答增强的研究表明，S特异性T细胞不会比个体初次疫苗接种后扩增得更多，即使抗感染的保护作用与中和抗体水平相关。T细胞抵抗感染的程度是未知的；然而，数据表明，T细胞在仓鼠模型中对新型冠状病毒引起的严重疾病的保护性免疫中起着关键作用，这保证了进一步测试BNT162b4与S蛋白编码疫苗在人体中的结合。目前正在进行的一项临床试验(NCT05541861)中评估T细胞靶向疫苗BNT162b4与BA.4/BA.5克隆适应的BNT162b2的有益效果。

研究的局限性

所有免疫原性和攻击性研究均在动物模型中进行，可能不适用于人类。此外，BNT162b4针对HLA复合物上的抗原呈递进行了优化，而不是小鼠或仓鼠MHC。然而，我们的质谱分析证实了来自BNT162b4的表位确实被加工并呈递到人类细胞系中的HLA复合物上。因此，我们期望在这些动物模型中观察到的免疫原性和保护作用将转化为人类。

对于新型冠状病毒攻击模型，我们选择使用金色叙利亚仓鼠模型，因为它相对符合人类的新型冠状病毒免疫病理学，与功效的良好描述的小鼠模型相比。虽然我们在新型冠状病毒攻击中使用的剂量不会导致致死，但病毒攻击的仓鼠有明显的体重减轻和肺部病理，这使得它可以作为研究免疫保护和疾病严重程度的有用模型，特别是在坚持人类病理生理学方面。非致死仓鼠模型更能反映自然感染和不同免疫成分的保护作用(与致死攻击中所需的非常高的人工剂量相比)。为了进一步扩展这一主题，我们在这些仓鼠攻击中使用了三种不同的新型冠状病毒变体(祖代、Delta和Omicron)来评估各种疾病的严重程度和BNT162b4诱导的保护作用。评估BNT162b4控制具有不同新型冠状病毒变异体的严重疾病的能力是重要的，因此仓鼠模型优于小鼠适应的新型冠状病毒模型。当在K18-hACE2小鼠模型中使用人类感染的新型冠状病毒菌株时，在K18-hACE2模型中小鼠脑中hACE2的表达87不仅由于呼吸系统病变，而且由于神经毒性，导致病变和死亡。因为我们相信T细胞在适当组织中的驻留可能在疾病控制中起作用，所以我们选择了与人类疾病生理学相关的动物模型。此外，T细胞应答在病毒清除中的预期作用机制使得非致死模型适合于研究T细胞靶向疫苗。

全部在活生物体内动物研究在新型冠状病毒幼稚模型中进行。这种模型在疫情开始时可能是合适的，但相当一部分人已经被新型冠状病毒感染，并且可能已经存在针对非S病毒抗原的记忆T细胞。此外，许多人已经接种了灭活病毒体疫苗，这也提高了不限于S蛋白的免疫力。由BNT162b2引起的S特异性细胞免疫已被证明优于由灭活病毒疫苗引起的免疫。这表明BNT162b4可以促进记忆T细胞反应或诱导重新这些受试者的反应，这并没有在我们的临床前模型中进行研究。虽然我们没有研究BNT162b4在新型冠状病毒经验动物模型中的作用，但我们预计BNT162b4将增强感染期间获得的现有T细胞免疫，提供额外的保护。因此，我们在幼稚模型中的研究可能低估了BNT162b4的免疫原性，对既往免疫的个体进行给药可能会提供更进一步的保护。

Arieta CM, Xie YJ, Rothenberg DA, Diao H, Harjanto D, Meda S, Marquart K, Koenitzer B, Sciuto TE, Lobo A, Zuiani A, Krumm SA, Cadima Couto CI, Hein S, Heinen AP, Ziegenhals T, Liu-Lupo Y, Vogel AB, Srouji JR, Fesser S, Thanki K, Walzer K, Addona TA, Türeci Ö, Şahin U, Gaynor RB, Poran A. The T-cell-directed vaccine BNT162b4 encoding conserved non-spike antigens protects animals from severe SARS-CoV-2 infection. Cell. 2023 May 25;186(11):2392-2409.e21. doi: 10.1016/j.cell.2023.04.007. Epub 2023 Apr 13. PMID: 37164012; PMCID: PMC10099181.