新型冠状病毒病毒载量和脱落动力学

Olha Puhach

摘要

新型冠状病毒病毒载量和呼吸道中传染性病毒的检测是估计传染性的两个关键参数。由于传染性病毒的传播需要脱落，了解脱落特征与公共卫生干预相关。病毒脱落受病毒的生物学特征、宿主因素和受感染个体的预存免疫力(以前的感染或接种)的影响。虽然人与人之间的传播过程是多因素的，但病毒载量在很大程度上促成了人与人之间的传播，病毒载量越高，继续传播的风险就越大。令人担忧的新出现的新型冠状病毒变种使病毒传播的情况更加复杂。在经历了近3年的疫情后，由于通过既往感染、疫苗接种或两者相结合的人群中的潜在免疫力在全球范围内迅速增加，病毒脱落模式变得与祖先新型冠状病毒的模式更加不同。了解影响传染性病毒脱落的因素和机制以及感染新型冠状病毒病毒的个体具有传染性的时期，对于指导公共卫生措施和限制传播至关重要。此外，需要诊断工具来证明来自常规诊断标本的传染性病毒的存在。

介绍

2019年底，一种新的冠状病毒出现，后来被称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)，它是冠状病毒疾病2019(COVID-19)的病原体。新型冠状病毒主要靶向上呼吸道(URT)的多纤毛细胞，但也有报道感染URT外的细胞、。它可以扩散到下呼吸道(LRT)，在那里感染肺泡，导致气体交换减少，炎症和肺部病变，这些都是典型的新冠肺炎。受感染的个人通过URT传播病毒，传染性病毒的传播导致二次传播，从而进一步传播病毒。

由于其非特异性的临床表现，需要精确的诊断工具来识别新型冠状病毒感染。病毒出现后，特异性实时PCR (RT-PCR)检测很快可用，随后是抗原检测(快速)诊断试验(Ag-RDT)和血清学检测。虽然通过RT-PCR检测呼吸道标本中的病毒RNA是高度灵敏和特异的，但它不能区分复制活性病毒和残留RNA。在没有诊断试验的情况下，传染性通常是用两种替代物之一来确定的:病毒RNA的存在高于规定值周期阈值，或一个阳性的Ag-RDT。RT-PCR是初步诊断的有用工具，而Ag-RDTs可以作为结束隔离期的指标。这是因为在没有感染性病毒的情况下，病毒RNA(可以通过RT-PCR获得)仍然是可检测的，而Ag-RDT的阳性与感染性病毒的存在有更好的相关性。

除了呼吸道，在外周血、粪便、尿液和眼部分泌物中也检测到了新型冠状病毒RNA。在大多数研究中，从非呼吸道标本中分离病毒是不成功的，在非呼吸道标本中发现传染性病毒的报告病例非常少。此外，发现来自呼吸道样品的病毒载量比来自其他材料的病毒载量高得多，后者通常具有与感染性病毒的存在不相容的RNA病毒载量。这种标本被认为与传播无关，因此，作者只关注通过呼吸道传播的新型冠状病毒病毒。

在这里，作者阐明了新型冠状病毒病毒载量和传染性病毒存在之间的关系，决定传染性病毒脱落的生物学和宿主因素，传染性病毒的测量以及诊断学作为传染性病毒脱落的代理的作用。

测量新型冠状病毒病毒载量

实验室诊断呼吸道感染的金标准是用从呼吸道收集的材料进行病毒特异性(半)定量RT-PCR来证明病毒RNA。最常用的材料是来自鼻咽或口咽的拭子样本，但是鼻腔拭子、唾液或含漱的液体溶液也被建议作为替代材料，其优点是对参与者来说是不太不舒服的过程。通过RT-PCR测定的病毒载量可以表示为每毫升病毒转运介质或每份拭子的病毒RNA拷贝数，也可以表示为任意的测试特异性Ct值。相比之下，传染性是通过在细胞培养物中复制病毒来定性或定量评估临床样本中的传染性病毒而确定的。方框中描述了测量病毒脱落的局限性1。在这篇综述中，作者将能引起感染的病毒颗粒称为感染性病毒，将病毒RNA水平(广泛用作感染性病毒的替代物)称为病毒载量。

方框1测量病毒载量的局限性

标本选择地点

为检测新型冠状病毒病毒而选择的采集拭子标本的解剖位置可能会影响病毒载量检测。据报告，鼻咽拭子的RNA病毒载量高于口咽拭子。因此，与其他上呼吸道样品相比，鼻咽样品显示出最高的诊断准确性。类似地，据报道，鼻咽拭子比唾液、鼻腔或舌下拭子的病毒分离成功率更高。然而，另一项研究发现，喉咙和痰液中的RNA病毒载量高于鼻拭子。两项研究表明，病毒可以更早地在喉咙中被检测出来或者唾液，但达到明显更高的水平，并在鼻子中保持更长时间的可检测性。一项荟萃分析使用鼻咽拭子作为参照，评估了不同的临床采样方法，结果显示混合的鼻拭子和咽拭子显示出最佳的诊断性能。值得注意的是，该分析

揭示了使用鼻腔或唾液样本的研究结果比使用混合鼻腔和咽喉拭子的研究结果具有更高的异质性。

拭子法(自我管理或由受过训练的人执行)对测量的病毒载量的影响不能被忽视:由卫生保健专业人员实现的抗原检测(快速)诊断测试的灵敏度高于自我测试。

个体感染动力学的影响

迄今为止，描述新型冠状病毒脱落纵向动力学的研究数量有限。大多数研究仅使用单个时间点从受感染的个体收集呼吸道拭子来测量病毒载量。因此，在比较不同患者之间的病毒载量时，症状出现的不同时间可能是一个混杂因素，这也可能解释病毒载量可用数据的差异。

流行期的影响

发现在单个时间点收集的标本的RNA病毒载量指示了流行病的轨迹，因为最近感染低周期阈值的个体的高比例与较高的繁殖数相关，指示了流行病的增长。类似地，RNA病毒载量的上升和下降与整个人群中新冠肺炎病例和住院人数相关，这是使用废水样本中的新型冠状病毒RNA测量确定的。此外，在中国，平均潜伏期估计值的变化在流行高峰前比高峰后短。因此，单个时间点的采样可能会因流行期而有偏差，可能会反映出比个体脱落动力学更多的流行病学动态。

受关注的新型冠状病毒变体的影响

关于相关新型冠状病毒病毒变异体的可用数据表明，尽管病毒载量动态的总体模式在变异体之间是保守的，但感染不同的相关新型冠状病毒病毒变异体会导致高度不同的感染性病毒量和RNA病毒载量以及新型冠状病毒潜伏期的变化。因此，从目前或早期新型冠状病毒变异体的脱落到新出现的变异体，推断作者的理解可能只有有限的价值。

传染性病毒的检测

确定呼吸道标本中是否存在传染性(即具有复制能力)病毒的金标准是在细胞培养物中回收病毒，该程序通常被称为病毒分离(图.1)。

图1:测量传染性病毒和RNA病毒载量的方法。鼻咽或口咽拭子标本用于检测新型冠状病毒病毒载量。通过定量实时PCR (qRT-PCR)进行病毒核酸(RNA)的检测。从裂解的病毒中提取病毒RNA，使用对病毒基因组中一个或多个靶区域特异的引物通过qPCR进行逆转录和扩增。样品跨越阈值(循环阈值)的扩增循环确定了病毒RNA的量。RNA病毒载量可以表示为每毫升的病毒RNA拷贝数，或任意的特定于测试的循环阈值。横向流动分析检测裂解的病毒颗粒中特定病毒蛋白的存在。新型冠状病毒核衣壳用于大多数抗原检测(快速)诊断试验。呼吸道标本中感染性(复制活性)病毒的存在只能通过分离细胞培养物中的病毒回收或通过使用50%组织培养物感染剂量(TCID₅₀)定量感染性病毒滴度来确定、病灶形成试验或蚀斑形成试验。通过在单层细胞上施加感染性培养基来进行病毒分离；感染后大约3-5天细胞病变效应的出现决定了分离的成功。白色表示细胞中存在细胞病变效应。为了定量传染性病毒滴度，进行呼吸道样品的系列稀释，并用于接种在单层细胞上。在TCID₅₀感染后3-5天，病毒诱导的细胞病变效应通常使用显微镜来定义。在病灶形成试验中，细胞在感染后1天固定，用病毒特异性抗体进行免疫染色以检测感染细胞组(病灶)。指示存在传染性病毒的病灶以蓝色显示。在噬斑形成试验中，平板在感染后2-3天固定并用结晶紫染色；具有单个噬菌斑的孔用于测定病毒滴度。指示传染性病毒存在的斑块显示为白色。

在新型冠状病毒的情况下，各种细胞系和原代细胞可用于病毒分离，包括表达血管紧张素转化酶2(ACE2；病毒进入所需的受体)或跨膜蛋白酶2(TMPRSS2；这对病毒进入也很重要)。源自非洲绿猴肾细胞的细胞系Vero E6通常用于病毒分离、繁殖和滴定。已成功用于新型冠状病毒分离的其它人细胞系是结肠直肠腺癌细胞系(Caco-2)、肺腺癌细胞系(Calu-3)、异位过表达ACE2的肺腺癌细胞系(A549)和人肝细胞癌细胞系(Huh7)。

使用光学显微镜定性评估细胞培养物中感染性病毒的存在，光学显微镜可用于鉴定经历由新型冠状病毒感染引起的细胞病变效应(和死亡)的细胞，包括合胞体形成、细胞变圆、脱离和变性。通常通过第二种方法来确认感染，或者通过对来自感染细胞上清液的病毒RNA进行特异性RT-PCR，通过与基线样品相比病毒载量随时间的增加来指示病毒复制，或者通过免疫染色对于病毒蛋白质。

然而，这种病毒存在的定性测量不能定量接种样本中的感染性病毒体，尽管病毒载量较低的样本通常显示细胞病变效应的延迟发展。相反，像这样的方法噬斑分析, 焦点形成分析或50%组织培养感染剂量(TCID₅₀)可用于定量患者样品中的传染性病毒。

上述方法是检测感染新型冠状病毒病毒的个体的临床标本中的传染性病毒的可靠工具，尽管存在局限性。活病毒颗粒的检测受样品质量的影响很大，传染性病毒颗粒在不合适的储存条件下会很快失去传染性。为了保存标本中的传染性病毒，来自新型冠状病毒病毒感染患者的拭子样本应立即浸没在适合细胞培养的病毒转运培养基中，并在收集后尽快储存在80℃下。长时间暴露在较高的温度下或反复的冻融循环会极大地影响样本的质量，导致传染性病毒颗粒可能完全丧失。因此，许多因素会影响不同实验室之间结果的再现性。此外，用于分离的细胞系可能在实验室之间表现出高度可变性，即使它们可能是相同的。细胞培养过程中使用的消耗品，如培养基或添加剂，如胎牛血清和抗生素，也可能影响病毒分离的成功。在模拟人类呼吸道主要进入部位的人类主要呼吸道上皮细胞中，与Vero E6细胞相比，分离感染性病毒的概率降低，这表明使用Vero E6细胞确定的感染性病毒可能被高估，无法评估体内传播风险。

重要的是，新型冠状病毒的所有细胞培养工作都是在生物安全3级条件下进行的，因此只有在拥有先进基础设施的实验室中经过专门培训的人员才能进行这些实验。因此，通过病毒分离来检测活病毒不适于诊断，并且仅限于研究。

RNA病毒载量的检测

通过RT-PCR检测病毒RNA的技术在疫情开始时迅速建立(图.1)。RT-PCR的高度特异性和敏感性使其成为诊断新型冠状病毒感染的金标准。定量RT-PCR分析提供Ct值，该值与临床样品中靶病毒RNA的浓度呈负相关(即，该值越高，样品中靶RNA越低)。通过使用具有确定RNA拷贝数的外标，Ct值可以转化为绝对病毒RNA拷贝数或每毫升病毒转运介质或每总拭子的国际单位。

尽管RT-PCR不能直接确定传染性，因为它不能区分复制活性(传染性)病毒和残留(非传染性)病毒RNA，但是已经研究了RNA病毒载量和传染性病毒存在之间的相关性。一些研究试图通过在一系列Ct值范围内分离病毒，将病毒RNA的量与传染性相关联。事实上，在症状发作后(dpos)的前8天内收集的样本中，随着Ct值的增加，病毒分离的概率逐步降低。然而，其他研究发现，传染性病毒和RNA病毒载量之间的相关性很低，病毒载量(或作为替代的Ct值)只是前5个dpo中传染性病毒存在的微弱预测因素。此外，当将某个Ct值或RNA拷贝数作为阈值时，不能确定RNA病毒载量是在增加还是已经在减少；因此，低病毒载量可以在感染结束时或在达到病毒载量峰值之前的早期(症状前)阶段测量。

在常规诊断环境中，分析灵敏度和检测限可能因检测和实验室的不同而有所不同。不同RT-PCR测定之间的分析性能比较显示了测量的Ct值和检测率之间的差异。因此，RNA标准的应用和基于标准曲线的RNA基因组拷贝数的计算可以提高实验室和检测之间的可比性。为了便于核酸扩增技术的校准和控制，世界卫生组织(WHO)引入了一种具有指定效力的灭活新型冠状病毒分离物形式的国际标准。

与传染性病毒的检测一样，其他几个参数也会影响病毒载量是否能被检测到。标本采集的地点会影响病毒载量的发现；尽管一些研究报道了鼻或鼻咽拭子中较高的RNA病毒载量，其他人在咽喉样本中显示出较高的RNA病毒载量。此外，用于样品的运输介质、样品的储存条件和质量可能进一步影响病毒RNA的检测以及推断潜在传染性时它们的有用性和局限性。

尽管新的变异体影响了一些基因靶标，但在大多数情况下，由于使用了双靶标分析(其中至少同时检测到两种病毒基因)，它们对分子诊断没有重大影响。

抗原检测快速诊断试验

大多数侧流试验设计用于检测鼻或鼻咽拭子中的新型冠状病毒核衣壳蛋白，作为传染性病毒的替代物(图.1)。事实上，当Ct值低于25-30时，大多数关于Ag-RDT检测的研究显示与RT-PCR阳性有很好的一致性，这是一个与感染性病毒存在相一致的病毒载量，而较高的Ct值给出的结果不太可靠。

在PCR检测呈阳性的个体中，感染早期的Ag-RDT检测结果通常为阴性。平均而言，第一个阳性Ag-RDT结果比阳性PCR结果晚1-2天获得，而在对祖先新型冠状病毒的研究中，患者的最高敏感性出现在前7个dpo期间。抗原检测显示，对于含有传染性病毒且Ct值低于25的标本，灵敏度最高，并且它们的阳性与传染性病毒的存在高度相关。相比之下，Ag-RDT对低RNA病毒载量(具有较高的Ct值)不太敏感。几项研究表明，Ag-RDT阳性与可检测到传染性病毒的时间之间有很强的相关性，这表明Ag-RDT可以为决定何时结束隔离增加一个额外的安全层。

然而，已经注意到研究和测试之间的一些不一致。例如，有报告称(在一系列研究和Ag-RDT中)在ct值较低和/或含有传染性病毒(超过早期急性期)的标本中检测不到病毒抗原。此外，很少有关于Ag-RDT在超过10天之后仍保持阳性的报道。由于大多数研究未能在超过10天之后分离出传染性病毒，因此尚不清楚超过10天的Ag-RDT阳性是否与传染性病毒脱落有关。一项研究表明，与6-11 dpos相比，抗原测试在1-5 dpos更准确地预测传染性。值得注意的是，在最初的11个dpos中，Ag-RDT阳性和感染性病毒分离之间有很好的相关性。

在Ag-RDT检测新型冠状病毒变异体的灵敏度和特异性方面，发现了相互矛盾的结果，制造商、Ag-RDT使用的环境类型(自我检测与卫生保健专业人员收集的检测)和用于检测的样本类型(鼻腔与口腔)之间存在很大差异。随着杂交免疫的增加和粘膜抗体的存在，Ag-RDT可能会进一步失去敏感性。

病毒载量和脱落动力学

病毒载量被用作表征传染性病毒脱落的替代物。个体保持传染性的确切时间很难估计，并且可能因患者而异。病毒因素(如病毒变异体)和宿主因素(如患者年龄、性别和免疫状态)会影响脱落动力学。

病毒载量是病毒脱落的关键决定因素

在2019年底新型冠状病毒出现后，在2020年1月发生的一系列感染中，首次测量了病毒载量和传染性病毒脱落的详细信息，评估了9名具有轻度病程的免疫功能正常的个体。RNA病毒载量峰值出现在症状早期的第5天，这一发现得到了其他研究的证实，这些研究报道了在症状发作时或之前不久的病毒载量峰值。在疾病过程中，鼻咽和咽喉拭子中的RNA病毒载量逐渐下降，在症状出现后2周达到低水平或检测不到(图.2)。对于结合抗体和中和抗体，RNA病毒载量的下降与临床症状的缓解和抗体滴度的逐渐增加相关。然而，在其他健康个体中，病毒RNA的持续检测被描述为持续时间长达28天。一些研究已经报道了通过RT-PCR低水平检测RNA，甚至几个月。通过RT-PCR初步检测后持续释放病毒RNA超过4周的参与者代表少数非严重病例，估计约为3% 14%或少于20%。

图2:轻至中度疾病患者的原型新型冠状病毒的RNA病毒载量和感染性病毒的动力学。根据不同的研究，祖先新型冠状病毒的潜伏期估计为4.6至6.4天。症状平均持续10天。在症状出现之前，已经可以检测到RNA，RNA水平在症状出现前后达到峰值，然后逐渐下降。RNA病毒载量的平均清除时间为症状发作后16天。传染性病毒滴度在症状发作前后最高，传染性病毒可在症状发作后8或10天内被分离出来。当不再检测到传染性病毒时，可以通过实时PCR长时间检测RNA，而通过抗原检测(快速)诊断试验(Ag-RDTs)检测病毒显示出与传染性更好的相关性。梯度反映了个体之间的可变性(接近感染末期的较浅阴影表明在一些但不是所有个体中继续检测到病毒载量)。灰色虚线表示初始感染，蓝色虚线表示PCR阳性期，红色虚线表示Ag-RDT阳性。用于生成Fig的基础研究的详细信息。可在补充表格1中找到。

据报道，通过细胞培养中的病毒分离确定的原型新型冠状病毒毒株的感染性病毒脱落与症状发作后早期急性期的高RNA病毒载量相关。重要的是，对患有轻度疾病或无症状感染的个体的呼吸道标本的每日纵向采样显示，在症状出现之前已经可以检测到传染性病毒。据报道，在第一个8-10天内成功分离出传染性病毒，但在此时间段后培养的可能性迅速下降。定量评估传染性病毒的研究发现，传染性病毒滴度在前10个dpos期间下降。此外，病毒分离几率的降低与血清转化因此，在住院患者中，传染性病毒不再能从抗体滴度可检测的血清转化患者中分离出来。尽管缺少对轻度症状患者进行的类似血清转换研究，但免疫原性个体的数量正在下降，这种广泛存在的潜在免疫使这种评估更加复杂。

大多数关于急性症状期传染性病毒脱落的研究都是针对患有轻度至中度疾病的免疫功能正常的患者，代表了社区中大多数新冠肺炎病例。因此，从这些研究中对URT中传染性病毒存在的评估被用于确定传染期的持续时间，并有助于隔离和检疫的最佳公共卫生实践。尽管轻度和重度患者的感染模式大致相似，但确实存在关键差异。就轻度和重度疾病患者之间的RNA病毒载量而言，疾病的第一周是可比的。然而，患有严重疾病的患者在患病的第二周RNA病毒载量升高，并且长期检测到RNA。此外，在长达32天的长时间内，从住院患者体内回收了传染性病毒；然而，从症状出现到病毒清除的中位时间与轻度或中度疾病患者相似。在LRT，重症新冠肺炎的特征也是持续的高RNA病毒载量，而在 URT和LRT，非重症病例具有相似的病毒载量。

据报道，在免疫功能低下的患者中，病毒RNA的检测时间延长；例如，在感染开始后224天，在感染HIV的人中仍然检测到病毒，包括检测到亚基因组RNA(sgRNA)表明活跃的病毒复制。此外，在从免疫功能低下患者收集的鼻咽拭子中回收了高达61个dpos的传染性病毒。在另一项研究中，在60 dpos时仍然检测到低RNA病毒载量。从接受以下治疗的患者的支气管肺泡液中分离出传染性病毒嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法入住重症监护室后最多28天78。一例免疫功能低下患者的病例报告显示，感染病毒的分离高达78天。从重病患者或免疫功能低下患者中分离出传染性病毒的报告有限(由于患者人数较少)，因此很难确定长期脱落病例的比例。

其他呼吸道病毒的病毒传播特征见方框2.

方框2呼吸道病毒的传播

呼吸道病毒之间的病毒传播动态不同，这影响了它们的传播，并对用于控制疫情的诊断和措施产生影响。

SARS冠状病毒

严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的流行始于2002年11月的中国广东省，并迅速传播到中国境外。这种病毒通过空气传播，也可以通过唾液飞沫传播，但在人群中的传播能力有限。在症状早期只检测到低病毒载量，通常在症状发作后10-14天左右在上呼吸道(URT)达到高峰，然后在感染后3-4周降至低水平。在感染SARS-CoV的患者中，从URT收集的样本中最多可检测到8周的病毒RNA，在痰液样本中持续52天，而感染性病毒从粪便和呼吸道标本中分离出多达28个dpo，从尿液样本中分离出多达36个dpo。SARS-CoV在低温下复制效率较低；因此，病毒复制在下呼吸道(LRT)比在URT更有效。值得注意的是，没有记录SARS-CoV的无症状或症状前病毒脱落和传播；传播的高峰出现在2和10天左右。结果，通过隔离感染SARS-CoV的有症状患者成功地控制了疫情，减少了继续传播。

中东呼吸综合征病毒

中东呼吸冠状病毒(MERS-CoV)于2012年从沙特阿拉伯的一名肺炎患者中分离出来，并被证明是中东一系列严重呼吸道感染的病原体。由MERS-CoV引起的疾病的特征是广泛的临床严重性和主要的呼吸系统症状，如急性病毒性肺炎，病死率高。该病毒能够通过空气传播，在人群中的传播率较低，最大估计繁殖数低于1。在LRT检测到的RNA病毒载量高于在城市地区。估计平均脱落持续时间在城市轨道交通为15.3天，在LRT为16.3天。在URT和LRT，延长的PCR阳性率和较高的RNA病毒载量与疾病严重程度增加相关。在尿液、粪便和血清中也检测到了病毒RNA。一项研究报道了34天内血液中病毒RNA的检测，并表明血液中病毒RNA的存在与较高的死亡率有关；然而，另一项研究未能从PCR阳性血清样本中分离出病毒。

流感病毒

在有症状的患者中，RNA病毒载量在症状发作前2天开始可通过实时PCR检测到，并在1 dpos时达到峰值。用甲型流感病毒进行的人类攻击试验表明，病毒载量在接种后1天已经急剧增加，在接种后2天达到峰值，在接种后8天变得检测不到。流感病毒的病毒脱落平均持续时间为4.8天，最长持续时间在6至7天之间。感染性病毒滴度的动力学与通过实时PCR检测的不同流感毒株的病毒载量趋势相似。在无症状患者中发现较低的RNA病毒载量和较短的传染性病毒脱落。

人类呼吸道合胞病毒

这种病毒是LRT感染最常见的病原体，导致发病率和死亡率，特别是在幼儿和老年人中。该病毒通过接触鼻腔分泌物或大型气溶胶传播。病毒载量和症状同时增加，在5.4天时达到高峰。在人类攻击试验中，平均4.6天可检测到呼吸道合胞病毒滴度。在9个dpos时仍可检测到病毒RNA，而在成人中1至8个dpos时可检测到传染性病毒滴度，儿童中高达9个dpo。

新型冠状病毒变异体的病毒脱落

随着时间的推移，新型冠状病毒病毒的进化导致了许多变种的出现。加上由于疫苗接种或自然感染而增加的群体免疫力，这导致需要重新评估作者对病毒传播模式的了解。

世卫组织将变异体指定为关注变异体(VOCs ),如果它们与以下一种或多种情况相关:高传播性或新冠肺炎流行病学的有害变化；毒性增加或临床疾病表现的改变；或者公共卫生措施或现有诊断、疫苗或疗法的有效性降低。迄今为止，五种 VOCs得到认可:α、β、γ、δ和ω。与祖先新型冠状病毒相比， VOCs在逃避免疫、病毒载量、脱落期甚至潜伏期方面表现出一些差异，从而导致完全不同的传播水平(图.3)。

图3:新型冠状病Delta和Omicron BA.1受关注变异体的传染性病毒载量和症状发作。脱落动力学的总体模式在新型冠状病毒变异体之间是保守的。与祖先新型冠状病毒相比，Delta和Omicron BA.1的潜伏期较短，估计Delta约为3.7-4天，Omicron BA.1约为3-3.4天。在感染Delta的患者中检测到的传染性病毒载量高于感染Omicron BA.1或祖先新型冠状病毒的患者。只有有限数量的研究确定了Delta和Omicron BA.1的病毒脱落何时结束，因此该时间点并不明确。由于比较不同新型冠状病毒变异体之间感染期终点的研究数量较少，传染性终点没有很好地定义(显示为颜色梯度)。用于生成图的基础研究的详细信息。可在补充表格2中找到。

与祖先新型冠状病毒相比，所有 VOCs都显示出病毒载量的变化。一项研究报道，与原始病毒相比，用α感染导致约10倍高的RNA病毒载量和增加的细胞培养分离概率。然而，另一项研究并没有发现α和祖先新型冠状病毒之间传染性病毒滴度的实质性差异。据报道，Delta导致RNA病毒载量更高的增加:一项研究报道，相对于祖先病毒，增加了1000倍，其他研究报告为1.7倍或6.2倍以上，病毒载量高于α。此外，Delta证明了细胞培养分离的概率增加和比α更高的传染性病毒滴度。尽管奥密克戎被证明具有高传播性，但较低的RNA病毒载量，更低的细胞培养分离概率和较低的传染性病毒滴度，在感染Omicron BA.1的患者中比在感染Delta的患者中观察到。即使在Omicron分支内，亚谱系之间也存在差异，Omicron BA.2感染导致RNA病毒载量水平更高，病毒清除时间比Omicron BA.1更长。

类似地， VOCs在病毒脱落的持续时间上也表现出差异。对呼吸道标本Ct值的分析发现，Delta病毒RNA的持续时间比祖先新型冠状病毒病毒长。另一项研究表明，在Delta和Omicron BA.1感染中，病毒RNA存在的平均持续时间没有显著差异。传染性病毒脱落的持续时间似乎与在祖先新型冠状病毒中观察到的相似，可培养的病毒在第5天获得，并且在感染Delta和Omicron BA.1的患者中没有分离出超过10 dpos的复制活性病毒。值得注意的是，无论是感染还是接种疫苗，对新型冠状病毒病毒的预先存在的免疫力可能会影响传染性病毒脱落的持续时间(以及免疫状态和疾病严重程度，如上所述)，这可能在疫情的过程中导致了一些差异。

年龄和性别对病毒脱落的影响

有证据表明，年龄相关和性别相关的先天和适应性免疫差异，以及成人比儿童更高的ACE2表达，导致老年男性患者患严重疾病的风险增加。此外，一些研究发现，年龄和性别影响病毒载量和脱落动态。在祖先新型冠状病毒感染的情况下，RNA脱落的解决在< 18岁的参与者中更快，在> 50岁的参与者中更慢。根据一项研究，在感染原型新型冠状病毒的男性患者中，可以更长时间地检测到病毒RNA，与女性患者相比，感染α或δ变异体的男性患者的RNA病毒载量升高。然而，病毒载量动态与年龄或性别的可能联系是高度争议的，因为其他研究表明它们对传染性病毒没有影响或者RNA病毒载量。

在祖先新型冠状病毒的早期研究没有发现病毒分离成功率的差异或者儿童和成人之间的RNA病毒载量，但样本量很小。当分析更大的队列时，在儿童中观察到比成人稍低的RNA病毒载量和更快的病毒RNA清除，而随着时间的推移，儿童和成人之间的脱落曲线模式相似。此外，跨不同年龄组的大规模病毒载量分析显示，儿童和成人之间的RNA病毒载量分布没有差异或仅略低的病毒载量(< 0.5 log10单位)在5岁以下的儿童中。

与脱落相关的症状

新型冠状病毒病毒传播的一个关键流行病学参数是潜伏期，定义为从接触或感染到出现症状的时间。对祖先新型冠状病毒的研究估计，潜伏期平均为4.6至6.4天(图.2)。使用原型新型冠状病毒进行的人类攻击试验表明，接种后2-4天开始出现症状，并且RNA病毒载量在接种后4-5天达到峰值。因此，病毒的人工接种证实了在自然感染个体中观察到的病毒载量峰值的时间，而在人类攻击病例中症状的出现更快。与自然感染相反，在人工接种中，具有高病毒载量的含病毒液滴直接应用于鼻中，因此更快地到达鼻上皮，这可能导致症状更快地出现。对于德尔塔，估计潜伏期为3.7至4天，而Omicron BA.1的感染潜伏期更短，为3-3.4天(图.3)。然而，由于感染的时间点在人类攻击试验之外很少为人所知，dpos在分析病毒载量和传染性病毒时最常用。

考虑到在受感染个体的URT中可检测到高病毒载量，无论其临床表现如何，症状的存在是传染性的不可靠指标。值得注意的是，感染新型冠状病毒病毒的个体在症状出现之前就具有传染性。据估计，大约一半的二次传播发生在症状前阶段。此外，根据人口调查，无症状病例约占所有新型冠状病毒原型新型冠状病毒感染的40%，并追踪新型冠状病毒确诊病例的密切接触者发现，高达23%的感染是无症状的。

关于有症状和无症状患者的病毒脱落差异，存在相互矛盾的发现。比较有症状和无症状患者之间的病毒载量仍然具有挑战性，因为无症状个体的暴露时间无法明确确定，并且在比较有症状个体的病毒载量时不能使用dpos。此外，在测试时没有表现出临床症状的个体可以代表真正的无症状个体或以后会出现症状的症状前个体。因此，只有对被评估个体进行随访的严格控制的研究才能明确区分症状前和无症状个体。一项对原型新型冠状病毒的研究跟踪了住院隔离的新冠肺炎确诊病例并每天记录症状，发现无症状和有症状个体之间的初始Ct值相似。类似地，在其他研究中没有发现有症状和无症状患者之间RNA病毒载量的显著差异，这些研究对患者进行了纵向随访，并且由卫生保健专业人员监测症状的存在或者是自报家门。相比之下，临床医生也记录了症状的其他研究报告了无症状参与者中较低的RNA病毒载量。此外，一项研究发现，无症状的人比有症状的人清除病毒RNA更快。另一项研究记录了无症状患者中病毒RNA释放的中值持续时间更长。

关于无症状患者中存在传染性病毒的数据有限。一项研究显示，从无症状患者中分离病毒的成功率较低，但只包括了一小部分患者。因此，更多评估无症状患者传染性病毒的研究将有助于阐明与有症状患者相比，其传染性的差异。

新型冠状病毒传输

病毒载量在新型冠状病毒病毒传播中起着关键作用。如前所述，宿主(疫苗接种或既往感染的作用)和病毒因素(新型冠状病毒变异体)极大地影响病毒载量动态，因此进一步影响病毒传播。

病毒载量对传播的影响

新型冠状病毒可通过呼吸、说话、打喷嚏或咳嗽时产生的较大飞沫和气溶胶传播，在较小程度上也可通过受污染的表面传播。由于感染只能由感染性病毒颗粒诱导，而不能仅由残余RNA或蛋白质诱导，因此二次传播需要感染性新型冠状病毒的存在。尽管传播是一个多因素过程，也会受到环境和行为因素(如湿度、空气质量、暴露时间或接触密切程度)的影响，但新型冠状病毒病毒在城市轨道交通中的载量被认为是传播风险的一个代表。

一项包括病毒载量分析的流行病学研究发现指示病例与向前传播密切相关，祖先新型冠状病毒病毒载量越高，表现出更大的续发率危险。在这项研究中，病毒载量被确定为传播的主要驱动因素，在家庭环境中的影响比在非家庭环境中(医院和疗养院等)更明显。传播概率在症状出现前后达到高峰，此时传染性病毒滴度估计在感染过程中最高。随着病毒载量随着时间的推移而减少，在感染原型新型冠状病毒的病例中，传播的概率也逐渐下降。关于这一点，一项对感染祖先病毒的卫生保健工作者的研究证明，在6个dpos之后没有来自指示病例的传播，这与显示在症状性疾病的第1周结束时病毒分离成功率降低的发现一致。

然而，当使用指数病例的病毒载量作为传播的代理时，存在局限性。迄今为止，导致二次传播所需的新型冠状病毒感染剂量尚不清楚，呼吸道中感染性病毒的存在与同一个体传染性之间的联系也知之甚少。在唯一可用的对祖先新型冠状病毒进行的人类攻击试验中，初始感染剂量为10 TCID₅₀在36名参与者中有16名没有导致感染。其他因素，如症状、接触类型、保护措施、疫苗接种状况和其他宿主因素可能对传播有额外的强烈影响。

病毒载量在个体之间可能存在显著差异(由于个体易感性和对既往感染或疫苗接种的免疫力)，这导致了他们传播病毒倾向的差异。事实上，在传染性病毒检测的持续时间以及鼻粘膜和口腔的病毒载量方面，作者已经观察到了祖先新型冠状病毒病毒和甲型流感病毒的差异。个体间的差异被认为在观察到的病毒载量动态的异质性中起作用，因为一些早期免疫信号与患者口咽RNA病毒载量较高显著相关。因此，观察到的个体间的异质性在正在进行的病毒传播中具有重要作用。

这种差异会导致病毒传播的异质性。根据祖先新型冠状病毒和α的模型估计，被称为超级传播者的高传染性个体在感染过程中传播的病毒比传染性最低的个体多57倍。相比之下，大多数新冠肺炎患者不会感染其他人，因为他们从气道中排出很少或没有病毒颗粒。事实上，只有少数(约8%)感染了祖先新型冠状病毒或α病毒的新型冠状病毒阳性患者的传染性病毒滴度明显高于其他人群(如一项在大量患者中测量病毒分离概率的研究所示)。而且，只有15%至19%导致了80%的祖先新型冠状病毒的二次传播。Omicron BA.1和BA.2也证实了类似的趋势，其中只有9%7至20%80%的传播是由传染性接触者造成的。

因此，超级传播事件的特点是传染性个体与大量易感个体密切接触，并且每次接触传播的可能性更高。除了影响这些事件的生物因素，社会行为和环境因素也有助于超级传播的可能性(例如，通风不良且没有其他感染预防措施的大型室内集会)。此外，特定地点可能代表着较高的传播风险(例如，许多超级传播事件发生在拥挤的室内环境中，如游轮、家庭聚会、聚会、老年人护理中心和医院)。

预存免疫在病毒脱落和传播中的作用

所有目前许可的新型冠状病毒疫苗都是肌肉注射，导致血清抗体升高，并防止因新冠肺炎引起的严重疾病和死亡，但不能长期防止感染。接种疫苗后产生的循环抗体水平随时间下降，但可以通过加强剂量升高。此外，目前可用的疫苗是使用第一个测序的病毒的刺突蛋白针对原始新型冠状病毒毒株开发的，并且针对其他基因变异体的严重疾病的保护程度有所不同、。此外，疫苗接种导致在粘膜表面诱导有限的中和抗体，这可能具有减轻病毒复制和预防更明显疾病的作用。例如，在一项研究中，在用mRNA疫苗接种后2周，在58%的参与者的唾液中检测到粘膜表面特异性的分泌成分抗体，但该水平显著低于恢复期参与者，并且其中和能力在接种后6个月显著衰退。对一小组未感染或感染Delta的个体进行的研究表明，疫苗接种诱导的粘膜抗体反应较低或检测不到，但突破性感染导致唾液中抗体滴度显著增加。然而，预先存在的粘膜免疫在传染性病毒脱落中的作用以及粘膜抗体和人类病毒载量之间的可能相关性尚未阐明。

由于抗体的减弱和具有免疫逃避特性的 VOCs的出现，在接种疫苗的个体中，突破性感染的报道越来越多，主要是因为Delta和Omicron VOCs的出现。在突破性感染中，目前的新型冠状病毒疫苗接种是否影响病毒载量(并因此减少)一直存在争议。因此，疫苗接种对病毒载量和脱落的影响是令人感兴趣的，因为这意味着疫苗接种不仅保护受接种者，而且还可以通过降低传染性病毒滴度或缩短传染性脱落期来帮助减轻病毒传播，因此具有超出对个体保护的影响。

总的来说，已经发现疫苗接种导致病毒载量降低(图.4)，虽然这随时间而减少。接种ChAdOx1疫苗(牛津-阿斯利康疫苗)或BNT162b2(辉瑞/BioNTech疫苗)可降低感染α病毒的个体的RNA病毒载量，但对突破性感染δ病毒的效果较弱。用BNT162b2免疫导致Delta突破感染的RNA病毒载量减少，尽管这种作用在接种后2个月下降，并最终在接种后6个月消退。用ChAdOx1疫苗免疫也导致VOC突破性感染中RNA病毒载量的减少。在大部分接受mRNA疫苗的接种患者组中检测到RNA病毒载量的更快清除，并且观察到从接种了mRNA或腺病毒载体疫苗的患者中分离出传染性病毒的可能性较低。尽管不是所有的研究都能证明在Delta突破感染中RNA病毒载量的减少。据报道，尽管病毒RNA水平相似，但在用mRNA或腺病毒载体疫苗接种的个体中，感染性病毒滴度较低。还发现疫苗接种影响传染性病毒的分离。在感染Delta的未接种疫苗的患者中，比感染Delta的接种疫苗的患者中，在细胞培养物中检测到存活病毒的中位时间明显更长。然而，在感染Omicron BA.1或BA.2的未接种、完全接种或加强接种的患者之间没有发现RNA病毒载量的显著差异，而在5日龄时定量测定的感染性病毒滴度在6日龄BA.1突破性感染中较低，仅在加强剂量后。其他研究表明，疫苗接种状态不影响传染性病毒分离的成功或者在感染Omicron BA.1的患者中从最初的阳性PCR检测到培养物转化的时间。这些研究表明，三联疫苗接种减少了感染性病毒载量，但没有减少从突破性感染中分离出感染性病毒的时间。

图4:疫苗接种对病毒载量的影响。在症状发作后的前5天，在感染了相关Delta变体的接种疫苗和未接种疫苗的患者中检测到相似的RNA病毒载量。然而，在接种疫苗的患者中病毒RNA的清除更快。感染病毒载量(IVLs)在接种疫苗的个体中明显较低，并且比感染Delta的未接种个体下降得更快。在感染另一种变体的情况下，接种个体中病毒载量的动态变化可能很大。用于生成Fig4的基础研究的详细信息。可在补充表格3中找到。

关于既往感染对病毒脱落的影响的数据有限。对祖先新型冠状病毒进行的一项研究表明，血清阳性个体中的RNA病毒载量低于血清阴性个体。尽管在先前感染了其它新型冠状病毒病毒变异体的未接种疫苗的患者中显示了较高水平的Omicron BA.1再感染没有关于既往感染对病毒载量动态影响的相关数据。

总之，这些发现表明，接种疫苗的个体比未接种疫苗的个体传染性更低，尽管这种影响的持续时间尚未得到系统研究。然而，关于疫苗接种对继续传播的影响，有一些相互矛盾的数据。在英国进行的一项流行病学研究发现，尽管完全接种疫苗的感染Delta的患者的RNA病毒载量比未接种疫苗的患者下降得更快，但RNA病毒载量的峰值是相似的，并且暴露于完全接种疫苗或未接种疫苗的指示病例的家庭接触者的二次发作率没有差异。相比之下，来自以色列的数据显示，与未接种疫苗的参与者相比，接种疫苗的参与者的家庭中发生的Delta传播较少。另一项来自英国的研究表明，BNT162b2和ChAdOx1疫苗均导致接种过疫苗的指数患者向前传播的减少，尽管检测到α比δ更强的减少，可能是因为如前所述，在感染δ的情况下病毒载量较高。最后，另一项研究发现，由于存活病毒脱落的持续时间较短，疫苗接种与减少δ突破性感染的向前传播有关。

总的来说，尽管目前使用的疫苗仍然基于原始病毒刺突蛋白，并且主要引发全身性而非粘膜免疫反应，但是已经观察到对病毒载量、传染性病毒脱落和传播的一些影响。此外，自2021年底以来，随着Omicron浪潮中突破性感染率的增加，许多个体表现出由接种疫苗与接种疫苗之前或之后的一种或多种自然感染组合组成的混合免疫。据认为，这种杂交免疫可以更好地控制粘膜中的病毒复制。

随着可以逃避现有免疫的新型变异体的不断出现，作者对疫苗接种对病毒脱落的影响的理解应该不断更新。需要更好地理解粘膜免疫的作用，以及引发局部而非全身免疫反应的潜在疫苗，以减少病毒载量作为控制新型冠状病毒循环的手段。

新型冠状病毒 VOCs对传输的影响

有几个可能的潜在原因导致新出现的变异体的传播性增加，这使得 VOCs能够迅速击败以前传播的毒株，包括病毒载量增加，建立感染所需的感染剂量较低，以及感染期延长。此外，新变异体的免疫逃避特性导致接种疫苗和先前感染的个体更易感染，并导致更高的传播性，正如在Omicron中观察到的那样。

具有改变的生物学特性的新型冠状病毒变异体的快速出现表明，关于病毒载量、病毒动力学和传染性病毒脱落的知识是变异体特异性的，并且每个新出现的变异体都需要重新评估。尽管对新型冠状病毒变异体的突变谱和相关表型的理解有所提高，但遗传性增强的原因是多方面的，而且还没有完全理解。迄今为止，脱落特征和传输特性不能基于序列容易地预测。与免疫逃避机制不同，脱落动力学，如传染性病毒滴度的动力学或新型冠状病毒变异体的潜伏期，不能从特定的突变模式中预测。在新型冠状病毒病毒进化方面仍然处于高度动态的情况下，理解病毒动力学及其对传播的影响仍然是高度公共卫生关注的问题。

新型冠状病毒公共卫生诊断学

作者确定传染性病毒存在的能力是指导公共卫生措施的关键，因为这将使传染性个体的隔离能够限制二次传播。不幸的是，目前不存在确定患者样本中传染性新型冠状病毒的即时诊断测试并且如上所述的病毒培养不适于诊断目的。因此，已经提出了一系列方法来寻找传染性的替代物，以指导隔离期。

一个例子是检测病毒复制过程中产生的sgRNA转录物，特别是负链RNA的合成。尽管sgRNAs在受感染的细胞中被转录，但它们不被包装在病毒体中，因此可以作为活跃复制的指示器，从而作为感染性病毒的指示器。除了基因组新型冠状病毒RNA的诊断性检测之外，还开发了特异性RT-PCR检测来检测sgRNAs，但是由于其灵敏度低于常规RT-PCR检测，这种检测还没有进入常规诊断应用。一些研究发现sgRNA的检测与传染性病毒的检测相关，而sgRNA在8天内很少检测到。然而，在最初检测到感染后17天，在诊断样本中检测到sgRNA或者在培养阴性的样本中，这可能是由于含有sgRNAs的双膜囊泡的稳定性和核酸酶抗性。因此，尽管sgRNA的缺失表明病毒复制的缺失，但sgRNA的存在并不一定表明传染性。

如上所述，Ct值也被用作传染性的代表。然而，如前所述，由于采集过程中的技术失误而导致的低质量标本可能会错误地表明不存在传染性病毒。此外，由于在感染开始时RNA病毒载量快速增加，低病毒载量，特别是在没有症状或在症状早期，并不排除个体不会很快进入具有最高传播风险的感染期。在这一时期，病毒载量达到峰值水平，导致大多数传播事件。

尽管Ag-RDT不如RT-PCR灵敏，但它们更便宜，可以在实验室设置之外进行，并且给出更快的结果，因此是指导隔离和限制传播的有用工具。RT-PCR测试的检测极限为每毫升10²–10³基因组拷贝数，而Ag-RDT的检测极限对应于每毫升10⁴–10⁶基因组拷贝数。感染个体通常具有每毫升基因组拷贝数> 10⁶的RNA病毒载量，这在很大程度上对应于大多数RT-PCR分析中的Ct为25，表明Ag-RDT是传染性的良好代表。然而，Ag-RDT的明显局限性，例如对接近感染末期的传染性病毒检测的灵敏度较低，不应该被忽视。Ag-RDT在检测新型冠状病毒 VOCs的灵敏度和特异性方面也表现出差异，随着新变种的出现，这是一个挑战。

总的来说，所有目前可用的诊断方法对于传染性病毒的检测都有一定的局限性。然而，即使这些测试在用作传染性的替代指标时只是作为不完善的工具，但作为公共卫生战略的一部分，它们的实施并不是为了预防每一次感染，而是为了减少社区中的感染人数，从而减少二次传播的数量。

结论

进入疫情的第三年，已经获得了许多关于新型冠状病毒病毒载量、传染性病毒脱落和传染性窗口的知识，尽管新出现的新型冠状病毒变种和不断增加的人群免疫力增加了情况的复杂性。

尽管在疫情期间在诊断领域取得了很大进展，但迄今为止，还没有可靠地确定传染性病毒存在的诊断试验。在这些不断变化的环境下，持续评估病毒传播特征，了解新型新型冠状病毒病毒变异体在病毒传播方面的生物学特性，对于指导公共卫生实践仍然非常重要。

Puhach O, Meyer B, Eckerle I. SARS-CoV-2 viral load and shedding kinetics. Nat Rev Microbiol. 2023 Mar;21(3):147-161. doi: 10.1038/s41579-022-00822-w. Epub 2022 Dec 2. PMID: 36460930; PMCID: PMC9716513.