室内酶联免疫吸附试验检测家犬抗狂犬病抗体的评价

Yul Fitria

摘要

众所周知，印度尼西亚在几个地区流行狂犬病，尤其是在苏门答腊、加里曼丹、苏拉威西和弗洛里斯群岛。目前，给犬接种疫苗已被证明是预防人类狂犬病最具成本效益的策略。应进行接种后监测，通过测量接种犬血清中的抗体滴度来评估接种是否成功。监测狂犬病特异性抗体滴度的血清学方法可以使用世界动物卫生组织(WOAH)推荐的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法进行。因此，我们为了支持犬类疫苗接种后监测而开发的内部ELISA (BukTi-Vet)需要与商用ELISA试剂盒进行比较，评估其诊断性能。使用111份已知的阳性血清和47份阴性血清来评估每个ELISA试剂盒的诊断性能。将使用本研究中使用的三种狂犬病ELISA试剂盒检测每种已知的阳性和阴性血清。BukTi-Vet是一种用于检测狂犬病特异性IgG抗体的内部ELISA，其灵敏度、特异性和准确性分别为98.19%、97.87%和98.1%。根据其阳性和阴性临床效用指数的值，BukTi-Vet非常适合用于针对确认(0.97)和筛选(0.94)测试的免疫分析。BukTi-Vet与Platelia II和RFFIT都表现出非常好的一致性，因此进一步完善为诊断试剂盒是令人信服的。应对接种了各种疫苗的犬进行现场血清试验，以提供更完整的诊断性能信息。BukTi-Vet与RFFIT表现出非常好的一致性，而Pusvetma和Platelia II仅表现出良好的一致性。BukTi-Vet与RFFIT的兼容性平均值可达94%。

介绍

狂犬病是世界上最古老的动物传染病之一，在人类中造成很高的死亡率。这种疾病是由狂犬病病毒(RABV)和来自弹状病毒科的其他病毒种引起的。尽管缺乏关于被忽视的热带疾病的全球负担的准确数据，但估计狂犬病的直接死亡最常见的传播途径是被患有狂犬病的动物，特别是犬科动物咬伤。大多数人死于狂犬病发生在亚洲和非洲。据估计，亚洲和非洲每年因携带狂犬病病毒的犬而导致的死亡人数分别超过30，000人和23，000人。

众所周知，印度尼西亚在几个地区流行狂犬病，尤其是在苏门答腊、加里曼丹、苏拉威西和弗洛雷斯群岛。然而，在以前被称为无狂犬病区的两个岛屿，即巴厘岛和松巴瓦岛，据报告发生了动物和人类狂犬病。巴厘岛的狂犬病爆发始于2008-2011年，并且案件持续到2016年。最近，松巴瓦岛在2018-2019年发生了狂犬病疫情。

目前，感染狂犬病的犬是人类狂犬病高发的主要原因，因此，为犬接种疫苗已被证明是预防人类狂犬病的最具成本效益的策略。应进行接种后监测，通过测量接种犬血清中的抗体滴度来评估接种是否成功。监测狂犬病特异性抗体滴度的血清学方法可采用世界动物卫生组织(WOAH)推荐的病毒中和和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法进行，该方法以前称为国际兽疫局(OIE) 。两种众所周知的病毒中和方法是荧光抗体病毒中和(FAVN)和快速荧光灶抑制试验(RFFIT) 。

尽管RFFIT被认为是评价成功接种疫苗的最可靠的测试，但不幸的是，这是耗时的、昂贵的，并且需要活的狂犬病病毒；有时，由于对细胞的细胞毒性作用，结果无法读出。病毒中和在技术上需要高度熟练的技术人员，难以标准化，存在一些实验室间的差异，难以每周进行一次，并且需要封闭设施，这只能在参考实验室中方便地进行。为了克服这一点，ELISA值得开发为RFFIT的替代物。与RFFIT相比，ELISA被认为技术上简单、负担得起、通量更高、更安全且快速。ELISA不需要活病毒和高防护设施，易于验证，对结果的一致性有更大的保证。还发现病毒中和(RFFIT)和ELISA具有良好的相容性。因此，ELISA非常适合大量样本的常规血清学检测，因此非常适合狂犬病疫苗接种后的抗体滴度监测。基于ELISA的技术最近被WOAH采用，用于国际宠物运动计划的血清筛选。印度尼西亚通常使用的商业ELISA试剂盒需要相当昂贵的进口试剂盒，而使用的国内产品准确性较低。因此，我们为了支持犬的疫苗接种后监测而开发的内部ELISA需要评估其诊断性能，并与商业ELISA试剂盒进行比较。

讨论

这项研究的结果证明，Pusvetma的诊断准确性与Dartini等人以前的报告相似。他们报道敏感性和特异性分别为96.8%和73.5%，估计诊断准确率为86.6%。在我们的研究中，Pusvetma试剂的敏感性、特异性和诊断准确性分别为82.88%、97.87%和87.34%(表1)。这些结果还表明，由于他们的研究和我们的研究之间的敏感性和特异性值的反向变化，诊断性能可能不一致。Pusvetma的CUI +ve和CUI ve值可估计为0.79(良好效用)和0.69(良好效用)。根据这项研究，已知已获得的CUI +ve和CUI-ve值分别为0.82(出色的实用性)和0.69(良好效用)。因此，Pusvetma用于病例发现(确认)和筛查(排除)的临床效用被归类为良好效用。然而，由于存在诊断性能不一致的迹象，ELISA试剂盒(Pusvetma)可能会对实际情况的评估产生怀疑和不确定性，尤其是在来自疫苗接种状态和疫苗接种后免疫反应未知的动物的血清样本中。

关于Platelia II的诊断性能的几个现有报告相对一致，其指的是灵敏度值总是低于特异性。一般来说，Platelia II的灵敏度往往在90%以下。据报道，当使用来自WOAH的阳性对照血清时，Platelia II的敏感性、特异性和准确性分别为88.8%、98.9%和90.5%。该诊断性能随后被用作该ELISA试剂盒附带的说明书中的最终性能，即Platelia Rabies II ad usum veterinarium(或简称为Platelia II)。然而，在同一份报告中，作者还告知，当使用R4b作为来自试剂盒本身的阳性对照血清时，Platelia II的灵敏度、特异性和准确性分别为91.1%、97.8%和92.2%。另一份报告记载，当使用R4b作为试剂盒中包括的阳性对照血清时，Platelia II的灵敏度和特异性为83.9%和100%，估计准确度为约85.3%。一份类似的报告还指出，使用试剂盒中包含的R4b阳性对照血清，Platelia II ELISA试剂盒的灵敏度和特异性为78.2%和100%，估计准确度约为89.1%。根据Servat等人报告的数据，CUI +ve和CUI ve值计算为0.88(优秀效用)和0.62(一般效用)。否则，根据Knoop等人报告的数据，可以计算出CUI +ve和CUI ve的值分别为0.84(效用极佳)和0.38(效用不佳)。因此，Platelia II对于病例发现(确认)的临床效用是极好的效用，而对于筛查(排除)，它是差的或一般的效用。参考上述报告中的数据，Platelia II不适合用于筛查目的的检测。

上述几位作者报道的所有研究结果仍低于本研究评估的Platelia II的诊断性能。我们的研究表明Platelia II的敏感性、特异性和诊断准确性分别为94.59%、95.75%和94.4%。我们研究中的CUI +ve和CUI ve值分别为0.93(出色的实用性)和0.85(出色的实用性)。因此，根据我们的研究，Platelia II ELISA试剂盒用于病例发现(确认)和筛查(排除)的临床实用性被归类为优秀。与我们的研究接近的临床效用表现是来自Servat等人的报告当使用R4b作为阳性对照血清时，得到的CUI +ve和CUI-ve值分别为0.91(极好的效用)和0.66(良好的效用)。不幸的是，这些数据并不是Platelia II中的最终诊断性能。

与其他两种商业ELISA试剂盒相比，BukTi-Vet提供了令人满意的诊断性能。诊断性能的评估结果也是一致的，这是指灵敏度值总是高于特异性，两者的值都总是在95%以上。这些优势可以从四点来观察。首先，诊断准确率总是在90%以上，而比较商业试剂盒在90%以下。第二，假阴性值低于两个对比ELISA试剂盒(图1)。第三，与其他两种ELISA试剂盒相比，它与RFFIT具有非常好的兼容性(表7)。四、基于临床效用指数的分析(表1)，BukTi-Vet被归类为确认测试(病例发现)和筛查测试(排除)的优秀工具。这种情况符合WOAH采用的国际宠物运动方案中使用ELISA筛选血清的要求。另一方面，从这项研究中，值得注意的是，Platelia II可以被归类为确认测试的优秀者和筛选测试的相当好者。虽然Pusvetma被归类为用于确认和筛选测试的良好工具，但由于其诊断性能不一致，因此有必要重新考虑其用于这两个目的。

ELISA和RFFIT之间测试的相关性通常用作评估检测狂犬病特异性抗体的血清学诊断性能的基础。然而，应当理解，这两种方法实际上并不总是可比的，尤其是这两种方法检测到的免疫球蛋白类别的差异。RFFIT也被称为功能性测定，其中抗体抑制狂犬病病毒感染的能力被确定(被称为病毒中和抗体),而ELISA是一种非功能性测定，其检测病毒抗原的某些种类的结合抗体。这是有时导致两种方法不兼容的主要因素之一。在实验或实验室条件下，ELISA和RFFIT技术都具有良好的兼容性，但在现场条件下，它们极有可能给出不同的结果，因此它们的兼容性较低。使用实验室质控血清(已知为阳性和阴性)进行ELISA和RFFIT之间的检测可以产生非常好的一致性。这一条件足以给出这样的预期:当ELISA试剂盒应用于现场样品时，与RFFIT的差异不会过大。

考虑到这一证据，Pusvetma和BukTi-Vet与RFFIT一致性水平的差异与检测到的免疫球蛋白类别的差异无关。BukTi-Vet发展的基本概念与Pusvetma非常相似。两者都使用来自巴斯德菌株的全病毒裂解物的天然蛋白质。这些差异应该与我们用于内部ELISA开发的配方和技术有关。简而言之，BukTi-Vet与Pusvetma相比具有区分血清阳性和血清阴性的优势，使其与RFFIT具有更好的相容性。

BukTi-Vet的评估显示了相当好的诊断性能的稳定性。该证据来自具有不同技能的三个操作员执行的测试的结果，这三个操作员仍然能够保持诊断性能而没有显著差异(P>0.05)他们三个之间。尽管如此，诊断性能指标的某些值仍有所下降，但下降幅度仍在容许阈值范围内，因此总体诊断准确度仍可保持在95%的值(表9)。与原始性能相比的显著下降(p<0.05)发生在从未使用过ELISA的无经验操作员进行的测试中。这也表明操作者的技能和经验会影响实际环境中使用的ELISA诊断试剂盒的性能。

三种ELISA试剂盒之间的组间一致性显示BukTi-Vet和Platelia II始终具有非常好的一致性(表4。Pusvetma和Platelia II或BukTi-Vet之间的assay协议仅被归类为良好协议。然而，涉及来自接种了Rabivet的犬的已知阳性血清的试验显示，三种ELISA试剂盒之间的一致性非常好(表5)。另一方面，使用来自接种了Rabisin的犬的已知阳性血清的试验之间的一致性仅显示Platelia II和BukTi-Vet之间非常好的一致性。Pusvetma与Platelia II或BukTi-Vet在来自接种了狂犬病疫苗的犬的已知阳性血清上的一致性被归类为良好一致性。这表明在来自使用不同疫苗接种的动物的血清阳性血清中，Pusvetma试剂具有不同诊断性能的趋势。

测量来自Pusvetma试剂的狂犬病特异性抗体的能力对来自接种了狂犬病疫苗的犬的血清具有更好的偏好。这是可以理解的，因为来自Pusvetma的Rabivet疫苗和狂犬病ELISA试剂盒是由同一家公司生产的。另一方面，Platelia II和BukTi-Vet对来自接种了Rabivet和Rabisin的犬的血清阳性血清具有相似的检测能力。这种情况与已知阳性血清中使用的两种疫苗类型的抗体滴度分布相似一致，这两种疫苗都用Platelia II和BukTi-Vet进行了检测(图2。使用Pusvetma在来自不同疫苗类型的两种已知阳性血清上测试的抗体滴度的分布与其他两种ELISA试剂盒的结果相反。这些数据引起了人们的关注，即当用于监测来自使用不同疫苗的犬的疫苗接种后血清中的抗体水平时，Pusvetma的诊断性能不够好且不一致。基于ROC的AUC评分，Pusvetma试剂的诊断性能没有显著差异(p<0.05)来自Platelia II和BukTi-Vet，用于接种过Rabivet疫苗的已知阳性犬血清(表2).然而，当用于来自接种了狂犬病疫苗的犬的已知阳性血清时(表3)，Pusvetma试剂的诊断表现有显著差异(p<0.05)与PlateliaII和BukTi-Vet一起。

可用于增加Pusvetma试剂诊断敏感性和特异性的策略是进行系列和平行检测的组合。用Platelia II和BukTi-Vet进行的系列检测的组合经计算可将诊断特异性提高至99.91%和99.95%(表8)。同样，Pusvetma和Platelia II与BukTi-Vet之间的平行检测分别导致高达99.07%和99.69%的诊断灵敏度。然而，决定进行串行和并行测试实际上并不容易，必须谨慎从事，因为它仍然存在测试结果不兼容的问题。最适当的行动是使用具有良好诊断性能并且与其他商业试剂盒具有良好测试兼容性的ELISA试剂盒。

结论

BukTi-Vet是一种用于检测狂犬病特异性IgG抗体的内部ELISA，其灵敏度、特异性和准确性分别为98.19%、97.87%和98.1%。基于其临床效用指数的价值，BukTi-Vet非常适合用于针对确认和筛选测试的免疫分析。BukTi-Vet与Platelia II和RFFIT都表现出非常好的一致性，因此进一步完善为诊断试剂盒是令人信服的。应对接种了各种疫苗的犬进行现场血清试验，以提供更完整的诊断性能信息。

Fitria Y, Febrianto N, Putri RE, Rahmadani I, Subekti DT. Evaluation of In-House ELISA for Antirabies Antibodies Detection in Domestic Canine. Vet Med Int. 2023 Jan 25;2023:4096258. doi: 10.1155/2023/4096258. PMID: 36743706; PMCID: PMC9891833.