第三代疫苗:核酸疫苗的特点和提高其效率的策略

摘要

基因免疫包括mRNA和DNA疫苗，由于其简单的设计、维护和高效性而脱颖而出。几项研究表明，针对伊波拉病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感和人类乳头瘤病毒(HPV)的临床前和临床免疫试验取得了令人鼓舞的结果。核酸疫苗的有效性在对抗新冠肺炎病毒的斗争中得到了强调，其在人类中的使用获得了前所未有的批准。然而，它们的低内在免疫原性表明需要使用能够克服这一特性并提高疫苗接种效率的策略。这些策略包括通过MHC改善表位在系统中的呈递，评估对新出现的病毒亚型具有高覆盖率的免疫显性表位，使用增强免疫原性的佐剂，以及提高疫苗转染效率。在这篇综述中，作者提供了关于这类疫苗的一些特性、构建和改进的最新进展，特别是关于合成多表位基因的生产，这些基因广泛应用于当前的基因疫苗中。

关键词:

疫苗; 核酸; 合成基因; 辅助者

图形摘要

1.介绍

纵观历史，作者经历了几次疾病爆发如何造成健康风险，其中许多疾病具有疫情病毒的潜力，最终导致全球数百万人死亡。伴随人口增长和全球化出现的新疾病表明，需要获得能够减少传染物传播和未来大流行风险的新工具。在这种情况下，疫苗是维护全球健康、提供保护以及有助于控制和抗击威胁人类和兽医健康的几种病原体的一种宝贵措施。在第一个疫苗诞生两个多世纪后，疫苗学领域促进了传统免疫技术的改进。这些方法包括使用减毒或灭活的病原体，甚至类毒素，以及创造和应用新的策略，如活载体和核酸。

2020年，在新型冠状病毒造成的新冠肺炎疫情中，保护措施的紧迫性促使科学界通过预先存在的研究迅速采取行动。特别是，基于核酸(DNA和mRNA)的平台在新冠肺炎造成的紧急情况下脱颖而出，并因其在人类紧急情况下的使用许可而成为疫苗史上前所未有的里程碑。这些疫苗策略中使用的抗原已经通过反向和结构疫苗学技术和生物信息学工具获得和设计，其中使用来自计算机验证的病原体、蛋白质或肽的数据，例如，用于构建疫苗抗原。

正如在最近的流行病爆发中所看到的，未来的大流行可能需要继续开发设计核酸疫苗的新模型和方法。特别是对于病毒感染，需要快速生产和更新疫苗平台。这些改进不仅对于无法通过接种疫苗控制的疾病至关重要，而且对于导致变异体出现或新血清型建立的突变的出现也至关重要。此外，除了开发佐剂和免疫调节剂之外，还必须投资于疫苗靶标的呈递，其可以是完整基因或基于计算机预测的表位的构建物。因此，这一研究领域正在不断扩大，特别是关于第三代疫苗。在这篇综述中，作者将重点放在开发核酸疫苗的构建体和提高核酸疫苗的效率上，强调合成多表位抗原的设计。

2.新技术:基因疫苗

基因疫苗包括采用DNA或RNA质粒作为抗原前体的免疫或免疫治疗方法。编码感兴趣抗原的基因序列(一个或多个基因)被宿主细胞摄取并翻译成蛋白质。这种所谓的第三代疫苗技术被认为是疫苗平台中的创新，被广泛用于新冠肺炎免疫计划，并具有变得越来越普遍的巨大潜力。此外，这些疫苗可以引发细胞和体液反应，并可以通过计算机工具进行改进，这些工具允许选择抗原表位，称为合成抗原疫苗。

其组成中含有RNA或DNA分子的疫苗的制造无需在具有高度生物安全性的实验室中大规模培养病原微生物，例如BSL3，这不利于常规疫苗策略，例如使用减毒或灭活疫苗的策略。此外，病原体的缺失阻止了病毒的再活化。这一方面有利于免疫缺陷人群的疫苗接种。

事实上，核酸疫苗在诱导CD4+和CD8+ T细胞应答的能力方面也比传统疫苗表现出显著的优势。mRNA分子固有的免疫刺激特性及其作为免疫佐剂的功能被认为是疫苗策略中可以利用的优势。将这些特性转化为安全有效的临床产品面临着平衡免疫刺激和编码抗原表达的挑战。最近，mRNA疫苗受到了特别的关注，并显示出优于DNA疫苗的一些优点，例如仅靶向递送至细胞细胞质，消除了基因组整合的风险，并独立于细胞分裂发挥其功能。由于半衰期相对较短，它们具有编码抗原的瞬时和受控表达，并且不存在额外的外源基因确保了它们的安全性。此外，无细胞生产减少了细菌成分污染的机会，并有利于在良好生产规范下生产。然而，RNA疫苗在其生产中需要额外的步骤，并且容易在体外和体内降解，而DNA疫苗更热稳定，便于其储存。

核酸疫苗相对于先前疫苗平台的主要优势之一是免疫反应靶向性的提高。此外，这种方法允许在同一疫苗中添加来自两种或多种变体的抗原，快速生产，并随后进行修饰以包括新的变体。尽管最初关注将疫苗质粒整合到宿主基因组中的可能性，但DNA疫苗已经显示出显著的安全性，并且没有证明整合的显著证据。DNA疫苗由编码目标病原体抗原的合成DNA序列组成，克隆在表达载体中。体内转染后，疫苗质粒需要到达细胞核，在那里发生mRNA的转录，随后在细胞质中翻译疫苗抗原肽。

翻译后，这些细胞内抗原在蛋白酶体内被加工，产生疫苗表位。然后，肽通过TAP转运蛋白被转运到内质网，并与MHC-I分子连接，以呈递到T细胞表面受体并激活细胞毒性反应。免疫反应激活的另一个途径可以发生在转染细胞(如肌细胞)产生和分泌疫苗抗原的过程中。这些分泌产物被抗原呈递细胞(APCs)吞噬，当通过MHC-II呈递时，可以激活辅助应答。辅助反应很重要，因为它允许免疫系统中其他细胞的交叉激活，如B和TCD8淋巴细胞[13].关于基因疫苗激活免疫途径的更多细节见图1.

图1.激活由核酸疫苗产生的免疫途径。施用疫苗后，可通过递送机制如电穿孔和脂质纳米颗粒将核酸引入树突细胞。(1)以电射线为代表，DNA电穿孔促进疫苗通过跨膜去稳定进入细胞，并有利于遗传物质进入细胞核及其随后的转录。(2)之后，mRNA形成并经历转录后修饰，使其脱离细胞核到达细胞质。(DNA和mRNA疫苗的途径是相同的，抗原的翻译发生在mRNA疫苗的胞吞作用之后。(4)由蛋白酶体加工的抗原性蛋白质产生与抗原加工(TAP)相关的表位，转运到内质网，并由MHC-I分子携带通过高尔基体囊泡展示在细胞表面。(5)因此，MHC-I呈递抗原表位和共刺激信号激活原始CD8+ T淋巴细胞，导致产生效应细胞毒性细胞，并诱导免疫记忆。(6)此外，由转染细胞如角质形成细胞和肌细胞释放的外源蛋白可被B细胞直接识别或被DC吞噬、加工并由MHC-II呈递。(7)在这种情况下，它们可以激活抗原特异性CD4+ T淋巴细胞，使其扩展为分化的亚型，释放细胞因子，并与B淋巴细胞相互作用，导致强烈的体液反应。在抗原刺激后，一些淋巴细胞作为记忆细胞(或哨兵细胞)迁移到不同的淋巴结，并为最终的感染做好准备。

3.核酸疫苗可以更好地指导免疫反应

这种激活不同免疫反应途径的多样性使得核酸疫苗可用于预防和治疗目的。从这个意义上说，由于预防性疫苗的主要目的是促进免疫记忆，这些策略需要通过特异性CD4+ T细胞产生强烈的体液反应。另一方面，用于治疗目的的疫苗主要需要细胞毒性CD8+ T细胞应答来识别并引起慢性感染或肿瘤细胞的凋亡。

作为预防性研究的一个例子，针对新型冠状病毒的mRNA-1273疫苗的效果证明了在人类中的高度中和和Th1-移位的CD4+ T细胞应答。这种反应模式涉及疫苗相关呼吸道疾病风险增加或抗体依赖性复制增加的降低。此外，mRNA组成和配方的这些特征与延长的蛋白质表达、抗原特异性滤泡T辅助细胞的诱导和生发中心B细胞的激活相关。

关于治疗方法，Rittig等人在IV期肾细胞癌患者中进行了基于I/II期mRNA的疫苗试验。直接注射裸mRNA诱导了安全有效的免疫反应，并具有由CD4+ T和CD8+ T效应细胞促进的特异性抗肿瘤免疫。在Cafri等人的研究中，一种用于转移性胃肠道癌患者的mRNA疫苗被证明是安全的，并诱导针对接种前未检测到的预测新表位的突变特异性T细胞反应。

关于DNA疫苗，两项临床研究测试了VGX-3100疫苗(NCT01304524)和GX-188E疫苗(NCT01634503) ，两者都编码基于人乳头瘤病毒-16和18的E6和E7基因的免疫原性肽。在第一项研究中，组织病理学结果显示49.5%的患者病变消退(n= 53)，而在安慰剂组，30.6%(n= 11)。此外，在这项研究中，免疫学分析表明，在接种疫苗的患者中，细胞毒性T淋巴细胞的特异性活化显著增强，体液应答增加。同时，在Kim等人的研究中，9名患者中有8名表现出特异性细胞毒性T细胞的多功能反应，9名患者中有7名表现出病变完全消退，36周随访后未检测到病毒。由于新冠肺炎疫情，面对突发公共卫生事件，不同的平台脱颖而出。DNA疫苗，如ZyCOV-D疫苗[23]最初在印度被批准用于紧急情况下的人体用药。其他的，如AG0302-COVID19 (NCT04655625)、GX-19N (NCT05067946)和INO-4800 (NCT04642638)，目前正处于II/III期试验，由编码新型冠状病毒蛋白的质粒疫苗组成。

mRNA疫苗的作用机制类似于DNA疫苗。主要区别在于免疫后，mRNA疫苗被运输到细胞质中准备翻译，而不需要到达细胞核。此外，mRNA分子不太稳定，需要经历结构变化，如修饰核苷。这些修饰包括在5’区添加合成帽，在3’区添加poly(A)尾，需要至少120个碱基才能形成成熟的mRNA序列。这些增量共同负责翻译效率的增加，避免细胞质核酸酶的分子降解。有两种类型的mRNA疫苗:非复制型mRNA疫苗，其仅编码靶抗原，以及自我复制型RNA疫苗，其除了感兴趣的抗原之外，还具有正链RNA病毒的复制机制，例如甲病毒、黄病毒、麻疹病毒和弹状病毒，使得疫苗能够在细胞内复制。

在自我复制mRNA疫苗的设计过程中，病毒RNA复制酶的编码序列是保守的，而病毒结构蛋白的编码区被抗原序列取代，从而防止了宿主中病毒体的形成。此外，真核启动子，如CMV启动子，被插入到疫苗序列中，以便被宿主的翻译机器识别。自我复制疫苗的作用类似于常规mRNA疫苗，除了在疫苗转染后，甲病毒复制酶被翻译并允许更多疫苗mRNA分子的后续复制。因此，与常规mRNA疫苗相比，需要低得多的疫苗剂量的自我复制mRNA疫苗来实现免疫潜能。

DNA疫苗已经在人类临床试验中进行了广泛的测试，其免疫原性、无明显反应以及对20μg-2500μg剂量的耐受性已经得到证实。该平台在室温下也具有很高的稳定性，不需要不间断的冷链运输和储存，有利于全球范围内的使用，特别是在贫困的农村地区和热带国家。同时，mRNA疫苗已经成为不同研究的焦点，特别是在癌症免疫治疗研究中，主要是那些使用抗原呈递细胞的离体修饰的研究。如今，由于在针对埃博拉和H1N1流感病原体的检测中取得了有希望的结果，该平台已经获得了显著的知名度并且面对它在新冠肺炎疫情时期的广泛使用。此外，新型冠状病毒疫情第一个获得许可的紧急疫苗战略是mRNA疫苗，即使在其他疫苗平台获得批准后，这种疫苗仍保持最高水平的效力。

人们一直在寻求优化mRNA疫苗的配方，以最大限度地提高其热稳定性。一个例子是由Sitiz等人开发的鱼精蛋白封装的常规基于mRNA的狂犬病疫苗。这项研究表明，通过每20个周期在4和56°C之间的温度振荡，以及在几个月的长期储存(从-80°C到70°C)后，疫苗的免疫原性和保护效果得以保持。

在细胞内，核酸疫苗可以模拟自然的病毒感染，因为它们作为细胞内抗原，可以在内源性产生后产生特异性细胞反应，并诱导抗体产生。此外，用DNA或mRNA疫苗转染的细胞不需要是专业的APC来产生能够刺激B或T细胞的蛋白质抗原。例如，一旦被邻近的肌细胞表达，疫苗抗原可以被APCs吞噬并进行免疫交叉呈递。

B细胞在预防性疫苗效力中的重要性不应低估T细胞反应的作用，T细胞反应对于诱导高亲和力/亲合力中和抗体和记忆细胞是必不可少的。这种作用可以解释为滤泡辅助细胞(Tfh)为次级淋巴器官的生发中心内的B细胞成熟提供支持，这可以产生高滴度的高亲和力和中和抗体。此外，辅助性Th1反应的激活刺激白细胞介素(IL-2)、干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-β)的分泌，具有直接的抗病毒功能并支持细胞毒性T细胞和巨噬细胞。相比之下，Th2反应被认为是通过低亲和力抗体的产生发展疫苗相关疾病增强的关键因素。

免疫系统双臂(体液和细胞反应)的完全激活对于避免抗体缺乏亲和力成熟至关重要。这一因素在新冠肺炎的情况下尤其重要，因为研究表明，在SARS-CoV(一种与新型冠状病毒病毒相关的病毒)的病毒攻击后，发生了疫苗相关疾病的增强。这个问题可以通过仔细选择计算机预测的疫苗抗原来避免，这些抗原必须是高免疫原性的，并含有MHC-I和MHC-II配体以激活细胞反应。

核酸疫苗，尤其是那些具有合成抗原的核酸疫苗，通过在合成构建体中包括由B淋巴细胞、MHC-I配体(细胞毒性反应)和MHC-II(辅助反应)识别的表位，或者优选地，同时包括所有这些表位，允许达到免疫反应的方向。在疫苗构建中包括T细胞表位的一个优点是它们可以来自病毒抗原的任何区域，或者位于内部或者位于蛋白质表面。然而，B细胞抗原的识别仅限于由位于病毒抗原表面的氨基酸组成的构象决定簇。

4.提高核酸疫苗效率的策略

尽管它们很有前途，但仍然很少有基因疫苗被批准用于人类。生产这些疫苗的主要限制包括核酸分子固有的低免疫原性、与体内转染这些分子相关的挑战以及RNA分子的不稳定性。因此，人们努力通过佐剂和载体来增强疫苗配方以提高效率。

4.1.增强表位对MHC系统的呈递功效

免疫信息学是一个在疫苗构建的生产中不断探索的领域，因为它提供了几个免费的工具、服务器和数据库，其中包含关于多表位预测和分析的信息。用这种方法开发的合成抗原可以在体内进一步验证，以提供可编辑的疫苗替代品，可以针对新出现的变异进行更新。

根据包含在免疫数据库中的信息，通过工具和在线服务器，有可能预测和分析包括在针对诸如人乳头瘤病毒的感染因子的预防性和/或治疗性多表位疫苗构建体中的表位。Sanami等人的一项研究将HPV16 E6和E7癌蛋白的表位包括在构建物中，在分析了抗原性、变应原性和物理化学性质后，该构建物被认为是一种有效的治疗性疫苗。另一种用于治疗宫颈癌的疫苗是用HPV16/18 E5和E7蛋白的表位设计的，并显示出稳定性、无毒性和非过敏性。Kumar等人更进一步，从L1、E5、E6和E7蛋白获得的肽设计了具有针对HPV16和18的预防和治疗潜力的多表位平台，所述肽可以诱导针对CD8+和TCD4+淋巴细胞的免疫应答。

在多表位疫苗的开发过程中，在仔细选择免疫原性表位及其在疫苗构建中的排列后，有必要确保免疫原被动翻译并通过APCs表面相应的MHC呈递。提高疫苗基因表达的策略是优化物种特异性密码子。研究表明，密码子优化可导致细胞和体液免疫反应增强。此外，在开发多表位疫苗的过程中，一个关注点是丢失“天然侧翼序列”的可能性，这可能损害通过蛋白酶体和溶酶体途径对表位的正确单独切割。

研究表明，MHC-I结合表位的侧翼残基对蛋白酶体对其的适当加工，进而对其呈递有强大的影响。利文斯顿等人分析了94种不同的表位/侧翼区组合，发现紧随羧基末端的残基类型会影响其免疫原性。这项研究发现，高水平的免疫原性与该末端存在碱性、酰胺或小残基相关。相反，低水平的免疫原性与脂肪族或芳香族残基的存在有关。因此，通过在疫苗构建中包含有效的侧翼区，有可能调节每个表位的免疫原性。

另一种方法是在表位之间添加间隔序列。这种序列被称为接头，并被特别设计以提供蛋白酶体和溶酶体切割位点，以及TAP转运蛋白的结合位点，从而提高MHC途径呈递的效率。一些例子是图案HEYGAEALERAG，AAY，GPGPG和KK(图2)。

图2.佐剂和接头在合成抗原中的作用。它们分别是帮助切割形成的肽和刺激免疫反应的序列。

4.2.增加疫苗免疫原性

尽管在以前的临床前试验中取得了令人鼓舞的结果，但DNA疫苗在高级灵长类动物和人类中显示出有限的免疫原性。这种限制可能是由于裸质粒DNA的低效摄取。一般来说，质粒在给药后会被截留在细胞外空间中，容易被核酸内切酶快速降解。因此，在给药部位可获得的少量抗原导致细胞对靶DNA的低摄取，这影响了待转录并随后翻译成疫苗抗原的分子数量。因此，佐剂给药对于克服大多数基因疫苗表现出的次优功效是至关重要的。佐剂可以多种方式起作用，例如增加抗原呈递(长效制剂、递送系统)；例如β-防御素、泛HLA DR和TAT。

一类重要的佐剂是toll样受体(TLR)配体。TLRs是免疫细胞表面(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6)和内体(TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)上发现的受体家族。这些受体可以快速识别病原体的保守分子特征，即病原体相关分子模式(PAMPs)，将它们识别为“危险的”，并增强促炎细胞因子的产生。此外，通过激活先天免疫反应，这些受体增加了树突细胞(DCs)向淋巴细胞呈递抗原的能力。

DCs细胞通过向引流淋巴结中的TCD4和TCD8淋巴细胞呈递抗原，在激活细胞反应中发挥重要作用。在缺乏危险信号的情况下，由于其表面缺乏共刺激分子(CD80/CD86和CD40 ),树突状细胞不能适当刺激T淋巴细胞。此外，在T细胞非依赖性抗体反应(通过B细胞受体[BCR])和T细胞依赖性反应(与生发中心的Tfh细胞一起作用)中，TLR有助于B淋巴细胞的直接激活。因此，这些受体整合了先天免疫和获得性免疫，是疫苗佐剂的极好靶标。

内体TLRs检测病毒和细菌来源的核酸，并能产生细胞毒性反应以消除病毒病原体和癌细胞。此外，TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9信号通路促进Th1反应，其淋巴细胞释放TNFα、IFNγ和IL-12，刺激B细胞产生高水平的IgG和IgA抗体以消除病原体。TLR9在DNA疫苗中的应用特别令人感兴趣，其通过非甲基化CpG基序的存在来检测非自身DNA。广泛用作疫苗佐剂的一类重要的TLR9激动剂是由CpG基序组成的合成寡核苷酸(ODN ),能够诱导强烈的细胞毒性反应。

佐剂分子的另一个有希望的例子是TLR-3激动剂，聚核糖肌苷聚核糖胞苷酸[聚(I:C)]。这种分子由双链RNA类似物组成，能够通过多种炎症途径诱导细胞信号。聚(I:C)尤其用于靶向树突细胞的制剂中，促进其成熟。在一项使用DNA疫苗的研究中，两种CpG/聚(I:C)佐剂的组合显示出明显更强的IFN-γ应答，并对细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ产生高水平的CD4(+)应答，对细胞因子IL-2和IFN-γ产生CD8(+)应答。另一项研究发现，聚(I:C)佐剂和瑞西喹莫特(一种toll样受体7 (TLR7)激动剂)在编码人乳头瘤病毒-16的E7基因的治疗性DNA疫苗中诱导显著的肿瘤消退。这项研究证明了IFN-γ和非特异性肿瘤内IL-12在小鼠中对Th1免疫模式的诱导。hlschlger等人也得出了类似的结果使用CpG盒导入治疗性DNA疫苗的质粒骨架，随后进行电穿孔(EP)。

除了TLR配体，许多其他种类的免疫调节剂可以通过共注射使用，或者甚至作为核酸疫苗中疫苗构建的一部分。细胞因子是一类免疫调节蛋白，对免疫细胞的信号传导至关重要，并能够影响它们的行为。一些研究包括编码生长因子、粘附分子、死亡受体和其他细胞因子配体的质粒。一个例子是白细胞介素-2 (IL-2)的使用，因为它在幼稚T细胞分化为有效T细胞和记忆细胞中起着重要作用[59].对包含IL-2的DNA疫苗的研究表明，流感的免疫原性显著增加[36]，SARS-CoV，以及艾滋病毒疫苗。在这些研究中，使用包括IL-2和免疫球蛋白G (IgG)的Fc部分的HIV-1 DNA疫苗的研究描述了恒河猴细胞反应的有效增加。

IL-12是另一种细胞因子，它在针对感染的先天免疫和适应性免疫之间提供了联系。此外，IL-12支持活化的Th1细胞的扩增，增加细胞毒性反应及其介质，如IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素，它们是细胞内病原体清除的关键因素。许多涉及在表达质粒中包含IL-12的研究已经证明了这种佐剂的高免疫原性作用，具有高IFN-γ产量和高水平的细胞毒性和辅助应答。大多数研究将DNA疫苗中的IL-12作用与电穿孔结合起来。

除了建立这些佐剂的概况，有必要评估它们将如何被递送和呈递至免疫系统细胞。它们中的许多被插入编码炎性细胞因子、趋化因子、干扰素和生长因子序列的DNA质粒中，并与核酸疫苗共同施用。通过整合IRES或T2A序列，将其它基因克隆到与感兴趣的基因相同的质粒上，从而允许抗原或佐剂在相同的载体中共表达。尽管最近有了实质性的改进，但分配可用佐剂的最合适方式仍有争议。

Lapuente等人观察到在小鼠中共施用H1N1抗原和含有组成型活性形式的RIG-I、IPS-I、IL-1或IL-18的质粒，随后电穿孔，不影响基于DNA的甲型流感疫苗的效力。另一方面，编码GM-CSF、Flt-3L和IL-12的pDNA单独或联合给药增强了HIV质粒DNA疫苗的活性。然而，Kumari等人创造了一种双顺反子疫苗，包括IFN-γ和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因之间的IRES序列迟缓爱德华氏菌感染诱发的。

4.3.疫苗转染效率增强

疫苗平台的类型代表了关于相关免疫反应强度的一个重要方面。例如，含有活病毒的疫苗准确地模拟了感染的自然过程，并在给药后通过循环迅速传播，到达其靶组织。这些病毒颗粒促进广泛的反应，并有助于传递与病原体相关的信号，从而调动先天免疫系统的反应。同时，非活疫苗，如核酸疫苗，由于缺乏复制活性而表现出有限的免疫反应，本质上是在给药时局部激活先天免疫反应。在这种情况下，给药部位和途径是选择的相关因素。

对于核酸疫苗来说，最常见的途径是皮内和肌内途径，因为在这些组织中可以获得树突状细胞，从而可以在不需要高抗原剂量的情况下成功免疫，尤其是在有限的免疫原性条件下。非活疫苗注射的另一种替代途径是血管化的肌肉组织，因为它具有含有大量树突状细胞的区域。一些途径可能不太有效，如皮下注射，因为这些细胞在脂肪组织中的分布较低。

而肌内途径(IM ),接着是电穿孔，被认为是DNA疫苗的最佳给药途径，对于mRNA疫苗，皮内(ID)注射似乎更合适。这种差异可能是由于通常用于携带mRNA疫苗的脂质体的阳离子性质，这取决于其在肌肉纤维中的流动性的大小和电荷性质，并因此干扰了纳米颗粒在DCs中的分布。因此，当使用这种给药途径时，可以应用带正电荷的较小颗粒(< 50纳米)来提高迁移率。然而，一些结果是有争议的，可能取决于其他因素，如疫苗剂量或佐剂，因为一项研究表明，DNA疫苗通过ID途径比IM途径更具免疫原性。因此，需要更多的研究来获得结论性的结果。

除了免疫途径之外，还必须确保核酸疫苗能够穿过生物屏障，并且能够在降解之前进入细胞。因此，改进核酸疫苗的递送系统构成了疫苗开发的重要研究领域。在这篇综述中，作者重点介绍了DNA的电穿孔(EP)和mRNA疫苗的脂质纳米粒(LNPs ),它们是提高核酸疫苗免疫原性的最常用系统。

多年来，电穿孔已被应用于一些临床前和临床试验中，以改善核酸和化疗药物向靶组织的递送。这项技术作为大分子的介绍性方法出现，并与这些分子在体内的表达增加有关。提出的作用机制包括通过应用电脉冲的跨膜去稳定化，这导致允许DNA直接进入细胞质的短暂孔。在该过程中，电泳效应负责将DNA运输到细胞核，增加质粒递送和细胞转染效率。Cappelletti 等人显示大部分插入的DNA在给药后约4小时降解。在这个意义上，EP有助于免疫效率的提高，因为它允许从组织细胞中摄取更多的质粒。此外，研究表明在电穿孔后产生的炎症环境中存在坏死和凋亡小体。含有疫苗肽的细胞碎片可被树突状细胞包裹，并激活辅助应答。

一项研究表明，电穿孔调节皮肤中促炎细胞因子的产生，提高转化生长因子-α (TGF-α)和IL-1的局部浓度。此外，EP允许朗格汉斯细胞在被导向表皮之前募集并与转染细胞相互作用[80].临床试验的初步报告显示在免疫疗法中EP后肿瘤抗原的成功递送。Vasan等人显示EP对应于能够引发DNA疫苗免疫原性的增加、持久性和幅度的安全技术。

Diken等人显示，在体外和体内研究中，通过大胞饮作用进行的鼠和人树突状细胞有效地内化了包裹在LNPs中的RNA。然而，除了适当的细胞递送之外，确保mRNA从内涵体中逃逸也很重要。因此，已经开发了一些策略，例如使用基于阳离子脂质的脂质体，阳离子脂质是pH敏感的脂质，在弱酸性介质(6.5-5.0)中会发生融合。MM27就是一个例子，它是一种由咪唑基团组成的脂质，在酸性pH下被质子化。这一过程增加了脂质体的融合特性，并促进了其去稳定化和胞质分布。已经研究了许多具有不同组成的其它脂质以提高基因的体内转染，例如1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇-2000 (DMG-PEG2000)。

苗等使用了一个综合数据系统，包括各种脂质制剂，来确定促进mRNA递送的可能机制，从而提供一个强大而特异的免疫反应。主要的脂质候选物显示出一些共同的结构，例如不饱和脂质尾、二氢咪唑配体和环胺基。这些制剂能够诱导APC成熟，并导致有限的全身性细胞因子表达，以及增加的抗肿瘤功效。

5.结论

第三代疫苗代表了疫苗学领域的巨大进步。新冠肺炎疫情加强了这一疫苗平台的重要性，提供了一个极好的例子，说明几十年前启动的先驱研究如何以前所未有的快速、高效、安全和具有成本效益的方式应用于抗击疫情。这篇综述汇编了第三代疫苗工程的研究趋势和可以提高其效率的各个方面。如本文所述，关于免疫系统的不断增长的知识支持了能够以更高效率、特异性和安全性激活免疫反应的分子的生物工程。现在的挑战在于进一步改进这项技术，以克服其局限性，如DNA分子的低免疫原性和RNA分子固有的不稳定性。在这方面，最近的研究正在开发用于疫苗递送的新一代生物分子以及新的佐剂。

除了这项工作中描述的进展，值得一提的是越来越多的研究为国际数据库提供信息，反过来支持生物信息学工具，除了改进现有工具外，还允许未来协助开发新工具。所有这些都将有助于在疫苗构建阶段提高表位预测的准确性。此外，由于下一代测序，已经观察到基因组序列的大量沉积，这反过来将有助于描述世界上不同人群的MHC谱，从而允许开发具有更大人群覆盖能力的多表位疫苗。本文讨论的研究和技术的所有这些进步都使人们对疫苗学的未来抱有积极的期望，有助于确保解决与挑战性病原体甚至复杂和多因素疾病(如癌症)相关的感染。

Melo ARDS, de Macêdo LS, Invenção MDCV, de Moura IA, da Gama MATM, de Melo CML, Silva AJD, Batista MVA, Freitas AC. Third-Generation Vaccines: Features of Nucleic Acid Vaccines and Strategies to Improve Their Efficiency. Genes (Basel). 2022 Dec 4;13(12):2287. doi: 10.3390/genes13122287. PMID: 36553554; PMCID: PMC9777941.