狂犬病诊断的替代方法

摘要

狂犬病每年导致大约59，000人死亡。为了实现“2030年零死亡”的目标，强有力的疾病监测加上改进的诊断在确保可靠数据和逐步证明狂犬病控制进展方面发挥了至关重要的作用。在这种情况下，组织能力验证以协调狂犬病诊断能力。在大多数实验中，狂犬病阳性样本包括从颅内接种的小鼠中收集的大脑。这一试验操作给动物带来了痛苦和严重的折磨，引起了不能再忽视的重要的伦理问题。在过去的几十年中，3Rs原则(替换、减少、改进)已经在多个科学领域成功实施，我们强烈支持将其应用于狂犬病疫苗效价检测。在这里，我们讨论了基于细胞的技术作为创新的可持续体外候选系统，以取代生产诊断能力测试样品的体内实验。这些替代方法的应用可以允许完全在体外生产狂犬病诊断能力测试板，这将代表对当前体内试验操作的重要替代或减少/改进。

关键词: 狂犬病; 诊断能力测试; 3Rs原则; 体外技术

1.介绍

狂犬病是一种人畜共患传染病，每年导致约59，000人死亡，主要在非洲和亚洲大陆的农村地区，其中绝大多数人的死亡是由犬引起的。在流行地区，人类和动物病例的监测数据薄弱，助长了忽视的循环，导致利益攸关方调动的资源很少，从而导致预防和控制措施不力。因此，由改进的诊断支持的强有力的疾病监测已被一致确定为“2030年零死亡”全球战略计划下目标2.2(确保为有效决策提供可靠数据)的一项指标，以终止由犬传播的狂犬病造成的人类死亡。

在这种情况下，狂犬病诊断能力测试(PT)是协调参与实验室诊断能力的重要工具，从而为提高诊断技能提供指导。实验室间试验(虽然略有不同，但在本手稿中，pt和实验室间试验是同义的)包括PT提供者(作为狂犬病诊断的参考)和数量可变的诊断实验室(接收一组盲编码样本，通过现场样本常规使用的狂犬病诊断技术进行检测。收集的数据由PT提供者进行分析，PT提供者报告每个参与者的表现，强调实验室诊断能力，并在需要时提出未来改进的实用建议。特别是在资源有限的国家，PT提供者还应该在实验室人员的技术培训、提供方案和试剂以及建立和验证新技术方面向诊断实验室提供支持。根据所应用的诊断技术，用于动物狂犬病诊断的PT板通常包括对狂犬病病毒的存在呈阴性或阳性的样品，包括病毒、抗原和/或病毒RNA。样本可以由脑组织印模载玻片组成或冻干脑材料。阳性样本主要包括不同的狂犬病病毒株(RABV ),可能还包括非RABV的狂犬病病毒株，尽管这种病毒很少见，但仍包括在PT板中，以评估诊断能力的广度。理想情况下，使用现场样本可以制备代表自然发生的动物狂犬病病例的PT板。然而，狂犬病阳性现场样本很少大量获得，如果使用这种材料，可能无法确保所需的面板均匀性。由于这个原因，在大多数PT试验中，阳性样品是通过小鼠颅内接种产生的。涉及大约30个实验室的PT练习需要大约500只小鼠，并且定期组织实验室间试验，因为实验室应该理想地每一到两年参与一次。尽管这种做法仍被广泛采用，但现在是时候问问我们自己了，就动物福利而言，是否可以开发出更可接受的试验操作，特别是如果我们考虑到放弃小鼠接种试验(MIT)而采用细胞培养试验等更新技术的强大压力。除了是一个痛苦和侵入性的过程之外，活狂犬病病毒的颅内注射给动物带来了严重的痛苦。为了确保脑组织中的大量病毒，该技术的实验终点在于神经症状的完全显示，并且与人类终点一致。

自威廉·拉塞尔和雷克斯·伯奇提出3r原则(用没有知觉的替代品代替动物，减少使用动物的数量，改进实验以改善动物福利和减少动物痛苦)以来，60多年过去了，这一倡议得到了越来越多的关注，对国际准则和地方政府立法以及全世界科学家进行动物实验的总体方法产生了积极影响。近年来在几种细胞系统和基于细胞的底物的生产和维持方面观察到的巨大进步强烈表明，在狂犬病诊断能力测试的框架内向前迈出一步并开发创新的可持续体外系统以替代或至少减少和/或改进当前体内实验的时机已经成熟。在本文中，我们筛选了所有我们认为可能产生影响的备选方案，并彻底改变了用于狂犬病诊断的PT板和用于常规诊断的阳性质控品的制备。

2.假设和意义

我们坚信，基于细胞的系统代表了在狂犬病诊断能力测试框架中取代使用动物的巨大机会。悬浮生长或作为细胞单层生长的传统细胞培养物、离体器官型脑培养物和更现代的3D细胞模型都代表了可持续的基质，可用于体外扩增狂犬病病毒和收集感染的材料，从而避免或显著减少动物的使用和痛苦(参见第四节了解更多详情)。目前使用的来自实验感染小鼠的大脑确实可以被细胞材料替代，这些细胞材料要么是以完全无动物的方式产生的，要么是从健康供体收集的，并且随后可以在体外感染。与目前的动物实验相比，后一种技术将代表一种重要的改进，因为动物将被安乐死以收集大脑用于随后的体外感染，但不会遭受狂犬病感染。因此，体外技术在狂犬病诊断能力练习中的应用有可能实现现代科学中强烈追求的3Rs原则(替换、减少和完善)。在狂犬病诊断和狂犬病疫苗生产领域，体外技术的应用极大地减少了用于狂犬病病毒分离和疫苗效力测定的动物使用量，详见下一节(参见第三节)。总之，这些实施例进一步支持PT板制备过程中的变化也是可能的(图1)。

图1.体外和离体方法可能有助于在狂犬病PT实践的框架内实施3Rs原则(替换、减少、改进),这反过来又有助于为实现ZeroBy30全球目标保证稳健可靠的诊断数据。

3.(最近)过去的例子

MIT（颅内接种分离狂犬病毒法）进行的狂犬病病毒分离代表了几十年来世界范围内用于诊断目的的常见做法，直到细胞培养的出现和快速组织培养感染试验(RTCIT)的发展，这导致了几个实验室常规诊断的逐渐但实质性的变化。除了与MIT相关的伦理问题之外，与RTCIT相比，这种技术更昂贵、费力、耗时，并且需要更多的时间(至少21天)来获得可靠的结果。相反，在细胞培养中分离狂犬病病毒通常在3-9天内得到结果，并且可以在没有动物设施的标准设备实验室中进行。此外，RTCIT的引入不仅避免了小鼠的痛苦，而且完全取代了动物用于狂犬病诊断。由于这些原因，目前所有国际组织都强烈建议应用RTCIT而不是MIT。然而，实时细胞培养技术仍然存在一些局限性，特别是在资源匮乏的环境中，在这种环境中，专用细胞培养设施以及生物安全要求并不总是可持续获得的。在这种情况下，分子方法的实施和普遍认可，如常规狂犬病诊断测试，有可能克服MIT和RTCIT的使用，这两种方法都不太敏感，因为它们需要有活的病毒，即新鲜或正确储存的样品。

3Rs原则的另一个重要实施是几年前在疫苗效力测试框架中引入的。美国国立卫生研究院(NIH)要求在免疫后对小鼠进行颅内病毒攻击的试验传统上用于评估人用和兽用狂犬病疫苗在批签发前的效力测试。然而，NIH测试提出了几个问题，涉及结果的高度可变性、昂贵的生物安全要求，当然还有如此严格的动物实验的伦理问题。国际组织和专家工作组在很大程度上鼓励用体外方法取代NIH测试；这导致了几种替代检测方法的发展，包括抗体结合试验、单向放射免疫扩散试验和一些酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来测量狂犬病糖蛋白的疫苗含量，该糖蛋白是刺激宿主免疫系统的主要蛋白质。欧洲药典目前接受经过验证的免疫化学或血清学效力检测来评估人类疫苗效力，这是3r实施的一个很好的例子，特别是作为动物使用的一个重要替代物。关于兽用狂犬病疫苗，许多研究报告称，由于疫苗佐剂的显著干扰，在开发能够可靠确定疫苗效力的ELISA测定法方面存在困难。但是，在欧洲药品和医疗质量理事会(EDQM)组织的一项合作研究中，已对兽用狂犬病疫苗的血清效价测定进行了验证，并已向欧洲药典专家推荐。通过避免病毒攻击和简单地要求免疫小鼠的抗体滴定，与经典的NIH试验相比，该血清学试验代表了显著的改进。

4.候选细胞技术和风险分析

几种体外细胞系统已广泛用于人类和兽医学，以取代用于研究和诊断目的的体内实验。这些技术中的大部分可以应用于代替在狂犬病实验室间试验的样本组制备中使用的小鼠。为了制备狂犬病阳性样品，从颅内感染的小鼠收集的脑通常在脑材料中稀释，所述脑材料从实验室、大型动物设施中可获得的大型哺乳动物或从先前狂犬病和各种嗜神经病原体检测阴性的野外尸体中收集。为了创新性地实施3Rs原则，因此，被狂犬病病毒感染的细胞基质应该取代通过实验室小鼠感染获得的被感染的大脑。

最简单和最有吸引力的方法是体外感染细胞单层，然后收集模拟感染小鼠大脑的感染细胞。几种细胞系，包括成神经细胞瘤、神经胶质瘤和成纤维细胞培养物，对狂犬病病毒感染敏感，并经常用于不同狂犬病毒株的细胞适应和扩增。因此，这些细胞系中的每一种或它们的混合物都有可能取代小鼠大脑来产生狂犬病毒阳性样本。此外，一些细胞系可以适应悬浮培养，无论是单细胞还是球体，使其更容易扩大到生产大量样品所需的体积。显然，细胞系可能并不同样适合于非RABV 丽莎病毒的复制和大量生产，这是一个需要进一步研究和开发的缺点。无论如何，细胞培养条件，包括例如感染的多重性、孵育时间和合适培养基的选择，应该通过实验确定，以便最大限度地收集感染的细胞。用受感染的细胞系替换受感染的脑组织的一个主要问题是，它们在可通过金标准技术、直接荧光抗体(DFA)试验或直接快速免疫组织化学试验(DRIT)检测到的病毒抗原的表达模式上可能不同，导致PT样品远离现场样品。我们认为，不同细胞类型的共培养物或不同细胞系的混合可以更一致地模拟受感染动物的大脑特征。无论如何，创新的体外样本应该通过一个盲测，然后才考虑在这个主题中进一步发展。使用受感染细胞系的初步尝试已被证明有希望取代标准的体内实验。事实上，替代体外方法的荧光模式与通过标准方法获得的荧光模式基本上没有区别(图2).

图2.对使用标准体内方法制备的样品进行直接荧光抗体测试(A)和基于感染的BSR和Neuro-2a细胞的替代体外方法(B).抗狂犬病核衣壳结合物(Biorad)用于检测狂犬病病毒抗原(绿色)。图像通过徕卡SP8共焦显微镜(63×物镜，25 m bar)获得。

在非原代细胞系证明不合适的情况下，可以用其他选择代替动物。三维脑模型，如类脑器官和器官型脑切片培养，也应作为小鼠脑的替代品进行评估。这些系统已成功用于脑病理生理学的研究，病毒感染的建模和溶瘤病毒疗法的研究，表明它们也可以适应狂犬病病毒的体外扩增。特别是，来自健康大型哺乳动物的脑外植体培养物的建立和体外感染可能代表了一种收集相对大量的感染细胞物质的简单方法，与目前痛苦的试验操作相比，这是对动物福利的一种极大的实验改进。然而，应特别注意在样品制备前对材料进行均质化，因为不同的脑部分可能对病毒感染具有不同的容许性和/或表现出不同的病毒抗原表达模式。在狂犬病诊断能力测试的框架中应用类大脑器官当然更加雄心勃勃和复杂，因为这些培养物的建立可能是漫长的，并且需要测试和设置大量的变量。然而，类器官中不同细胞类型的存在和所获得的细胞团可能会对最合适的细胞系统的定义产生影响。

5.评估分子诊断能力

分子方法，包括终点和实时RT-PCR，最近在可靠的诊断方法中被提及确认通过DFA测试获得的结果，或者在质量差的样品(即腐烂的田间畜体)的情况下，通过DFA检测给出不确定的结果。因此，一些能力验证可能专门针对评估参与实验室的分子诊断能力。值得注意的是，这种类型的PT练习提供了实现3Rs原则的可能性，比侧重于DFA和病毒隔离的练习更容易，值得在本主题的背景下进一步讨论。通过RT-PCR检测狂犬病病毒RNA的第一个实验室间试验由弗里德里希-雷夫勒研究所(FLI)组织，涉及16个欧洲实验室，分析了一组26个RNA样品，这些样品以前是从原始脑材料或细胞培养上清液中提取的。在准备这些小组时，实际上没有进行动物感染，这当然是3r原则框架内的一个值得注意的成就。然而，从诊断样本中提取病毒RNA可能是诊断过程中的一个关键步骤，应在参与PT练习的实验室中进行，以便更可靠地评估其性能。事实上，这与为DFA和DRIT等技术获得适当质量的样品一样重要。在这种情况下，通过制备由掺有病毒RNA的未感染脑材料组成的PT样品，向前迈进了一步，如我们小组最近所述。为了生产这些样本，DFA测试为阴性，RT-PCR测试为阳性，没有小鼠被实验感染，RNA提取仍然是参与实验室进行的诊断过程的一部分。病毒RNA可以是合成的或总的，预先从野外样品或细胞培养上清液中提取。值得注意的是，尽管已知RNA不稳定，但掺入RNA的样品证明非常稳定，并且还具有完全无传染性的优点。制备非传染性PT板的机会对于携带者和实验室工作人员来说都是生物安全方面的一大成就，并且可以显著降低交付成本。最后，此处报告的分子PT实践证明，3Rs原则的部分但重要的实施已经得到验证，而需要更多的研究来开发完全体外的狂犬病PT方案组。

6.结论

3Rs原则是全世界动物科学中最受赞助的方法之一。这不仅是因为不容置疑的伦理原因，也是因为在整个环境链中使用大量动物的影响。与这一考虑相一致，动物数量的减少与成本的降低和对更可持续的科学的资源消耗的减少相关联。在狂犬病诊断的实验室间试验中，验证体外模型来替代或减少/改进动物的使用是一个有趣的挑战。此外，深入研究经典和最新细胞模型在狂犬病病毒研究中的所有可能应用，不仅对狂犬病诊断能力测试，而且对致病性和治疗性研究都有重要影响。总之，我们认为在狂犬病实验室间试验的框架内实施3Rs原则是值得深入研究的，因为现代可用的基于细胞的技术可以产生影响。

来源：Zorzan M, Gourlaouen M, Leopardi S, De Benedictis P. Alternative Methods to Current In Vivo Procedures to Address the 3Rs Tenet in Rabies Proficiency Testing. Viruses. 2022 Jul 31;14(8):1698. doi: 10.3390/v14081698. PMID: 36016320; PMCID: PMC9414609.