来自康涅狄格州浣熊变异狂犬病病毒的基因组测序和分析

狂犬病病毒是一种人畜共患的RNA病毒，通常通过被感染动物的叮咬传播通过唾液。感染攻击中枢神经系统，如果患者在暴露后没有及时接受暴露后预防治疗，可能会导致呼吸停止、瘫痪、脑炎、昏迷或死亡等症状。该病毒导致全球每年59，000人死亡，在病毒流行病学和动物分布方面表现出极大的多样性。疾病控制和预防中心(CDC)每年报告大约5，000例动物狂犬病病例，并且美国的大多数病例来自野生动物，其威胁传播给家畜甚至人类。

在至少30种已鉴定的动物中检测到狂犬病病毒，主要由陆地食肉物种组成，包括浣熊、臭鼬和蝙蝠，并分布在美洲、欧洲、亚洲、非洲和澳大利亚。在北美，浣熊变种狂犬病病毒(RRV)令人担忧，因为它在野生动物中传播相对较快，并可能对公共卫生产生影响。在美国，近几十年来，RRV的流行地理范围已经扩大到整个美国东海岸。RRV最早于1991年3月在康涅狄格州报道，当时在与纽约州；从那以后，RRV已经遍布全州。2018年，康涅狄格州报告的浣熊狂犬病病例数量比2017年增加了15.4%。

下一代测序(NGS)方法使得无需分离直接从临床样本中进行病原体的全基因组测序(WGS)成为可能。尽管全基因组宏基因组学具有潜力并且最近取得了成功，但在直接从临床样本测序时，通常需要针对特定病毒的靶富集来产生完整的病毒基因组覆盖。平铺扩增子组方案已经用于产生病毒基因组的完全覆盖。对于狂犬病病毒来说，基于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的病毒特异性基因组富集方法已被用于全基因组测序。在这里，作者优化了一个多重平铺RT-PCR协议，其中选择性引物集在三个反应中覆盖了RRV的整个编码区(CDS)，并成功测序和分析了2017年至2019年期间在康涅狄格州鉴定的42个RRV阳性动物脑样本。

根据2019年美国狂犬病监测，在所有检测到的患有狂犬病的野生动物中，浣熊的比例最高(32.9%)(n= 94，770)后面是臭鼬。与之前的发现一致，2017-2019年期间在康涅狄格州浣熊和臭鼬中检测到的高数量表明了RRVs在美国东北部的维持和传播中的关键作用。这些物种高度适应城市环境，增加了人类和动物群体接触狂犬病的风险。因此，如果RRV病毒爆发，需要有效的基因工具来调查。

根据作者的数据和经验，通过直接荧光抗体试验确认的狂犬病阳性样本包含足够量的病毒RNA，大多数克拉-对于多重平铺RT-PCR和基因组测序，RT-qPCR中的值< 30。作者新优化的多重平铺RT-PCR方案与预先选择的引物组一起使用，该引物组通过三个扩增反应覆盖RRVs的完整CDS。虽然传统的NGS协议在过程中涉及高成本、劳动力和复杂性，但作者的方法既省时又经济。多重拼接RT-PCR结合一个负担得起的台式Illumina NGS系统显著提高了实验效率。该方法能够以少得多的实践时间和实验步骤从临床样品中选择性富集病毒基因组。

所述方案的使用允许对美国东北部的循环RRV进行快速有效的基因组测序。基于CDS的ML系统发育分析显示，在康涅狄格州检测到的rrv和在邻近州检测到的rrv之间具有高度的遗传多样性。这里生成的数据表明，通过野生动物的移动和康涅狄格州每个病毒亚类的独立进化，RRVs可能在康涅狄格州和美国东北部其他州之间传播。

总之，作者报告了2017-2019年期间使用作者的多重RT-PCR方法在康涅狄格州检测到的RRV被动监测WGS数据。结合最新优化方法的系统发育分析为未来的RRV监测提供了有用的方法工具，包括评估RRV在北美的进化和传播。

原文链接：Genome sequencing and analysis of the raccoon variant rabies lyssaviruses directly from clinical samples, Connecticut, 2017-2019

Front Vet Sci. 2022 Sep 23;9:1001204. doi: 10.3389/fvets.2022.1001204. eCollection 2022.