人源狂犬病单抗体混合制剂可广泛中和北美狂犬病病毒变异株

——人源单抗是狂犬病暴露后预防的有希望的候选药物

摘要

人类狂犬病仍然是一个全球性的重大公共卫生问题。用单克隆抗体(MAb)替代多克隆抗狂犬病人免疫球蛋白(RIG )用于狂犬病暴露后预防(PEP)的被动免疫制剂，将消除与RIG相关的成本和可用性限制。我们的团队开发并授权了一种人类单克隆抗体RAB1 (Rabishield©)，作为在犬狂犬病流行地区的狂犬病人免疫球蛋白的替代品。然而，对于高度多样化的北美狂犬病病毒，应包括含有针对狂犬病糖蛋白不同抗原位点的两种或多种单克隆抗体的混合制剂，以确保中和病毒的所有变异株。在这项研究中，鉴定了两种MAb鸡尾酒R172 (RAB1-RAB2)和R173 (RAB1-CR57 )，并针对来自北美的广泛狂犬病病毒（RABV）变异株进行了评估。R173被发现是最有效的混合制剂，因为它中和了所有测试的北美RABV分离毒株，并显示了对来自陆地和蝙蝠物种的分离毒株的广泛覆盖。R173有望成为北美狂犬病人免疫球蛋白PEP的替代品。

介绍

狂犬病病毒(RABV)是一种人畜共患的病原体，既有野生动物宿主也有家养动物宿主。人类感染RABV会导致急性致命疾病，并伴有迅速发展的脑炎。全世界每年大约有61，000人死于狂犬病，其中大多数是儿童，这使得人类狂犬病成为一个重大的公共卫生问题。在亚洲和非洲，几乎所有人类狂犬病感染都是被犬咬伤的。然而，在美国，大多数人类狂犬病病例是由于接触食虫蝙蝠和包括臭鼬和浣熊在内的陆生动物引起的。

狂犬病的死亡率可以通过及时给予暴露后预防(PEP)来预防，包括伤口护理以及分别用狂犬病免疫球蛋白(RIG)和狂犬病疫苗进行被动和主动免疫。服用得当，PEP可有效预防疾病；并且施用PEP后的人狂犬病治疗通常偏离严重暴露环境中的治疗程序。

在美国，估计每年进行36，000个狂犬病PEP疗程6。狂犬病PEP的成本在美国和世界各地差异很大，其中大部分成本来自狂犬病人免疫球蛋白7。RIG由RABV免疫的人供体(hRIG)或超免疫的马(eRIG)的血清产生。在世界范围内，由于生产大量分级血液制品的费用，设备短缺。施用来自人类供体或马的RIG也可能由于风险因素而造成潜在的安全威胁。

    针对RABV糖蛋白(G)的人单克隆抗体(HuMAb)已被提议作为RIG的替代物，几个候选物已经进入临床阶段8。我们的团队已经开发并表征了一种HuMAb，RAB1，被许可为Rabishield，作为在犬狂犬病流行的印度PEP的狂犬病人免疫球蛋白替代物9，10。印度的一项分析表明，人类单克隆抗体RAB1中和所需的糖蛋白氨基酸残基在陆生动物的所有RABV分离株中是保守的。这表明，在几乎所有狂犬病感染都是由陆地分离株引起的地区，单克隆抗体(MAb)足以用于狂犬病PEP。

在北美开发用于狂犬病PEP的单克隆抗体产品的主要挑战是RABV变异株在陆地和蝙蝠分离毒株中的高度多样性。有七种RABV变异株在美国的陆地哺乳动物中区域性传播:浣熊、中北部臭鼬、中南部臭鼬、亚利桑那灰狐、加利福尼亚臭鼬、北极狐和犬-猫鼬。在加拿大和墨西哥，RABV变异株在类似的陆地宿主中传播，包括加拿大和墨西哥的臭鼬、墨西哥的灰狐和加拿大的红色北极狐。除了陆地宿主，几乎每种蝙蝠都带有一种或多种吸血蝙蝠的RABV变异株圆形叶口蝠成为墨西哥关注的变异株。美国最近的人类狂犬病病例主要是由三种蝙蝠RABV变异株引起的:银发蝙蝠夜盲蝽(Ln)，三色蝙蝠下腭肌周炎(Ps)，还有墨西哥自由尾蝠游离尾蝠(Tb)。

    狂犬病人免疫球蛋白在美国一般都能买到。然而，为了防止潜在的RIG短缺并消除血清产品的血液传播的理论风险，正在开发单克隆抗体作为狂犬病PEP RIG的替代物。基于RABV 蝙蝠变异株的多样性，可能需要一种以上单克隆抗体的混合制剂来确保在北美中和所有变异株。世界卫生组织(WHO)建议，如果考虑用单克隆抗体预防狂犬病，那么至少应使用针对G蛋白不同抗原位点的两种单克隆抗体。FDA最近也发表了一份文件，作为这种抗体鸡尾酒的商业开发指南。为此，本研究的重点是开发和鉴定两种识别RABV包膜糖蛋白上不同且非竞争性抗原位点的单克隆抗体。在这里，我们开发了两种抗狂犬病单克隆抗体鸡尾酒R172和R173。这两种鸡尾酒都针对北美广泛的RABV变异株进行了评估。发现R173对来自北美陆地和蝙蝠物种的所有测试RABV分离毒株提供完全覆盖。

材料和方法

抗体克隆、表达和纯化

RAB1和RAB2先前被开发为抗狂犬病糖蛋白人单克隆抗体，其分离自如前所述用狂犬病疫苗免疫的人IgG转基因小鼠。通过RT-PCR从杂交瘤细胞中扩增RAB1和RAB2的重链和轻链可变区，并克隆到含有人IgG1的重或轻恒定区的pcDNA 3.1 (Life Technologies)载体中。对于MAb CR57，轻链(GenBank: CS239779)和重链(GenBank: CS239777)的可变区序列被合(GenScript Inc)并克隆到如上所述的IgG1表达载体中。

抗体在用编码RAB1、RAB2或CR57 IgG1的DNA稳定转染的CHO细胞中表达。通过离心收集细胞上清液，然后与蛋白A琼脂糖树脂(GE Healthcare)在室温下孵育2小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤珠子，用pH 2.8的100 mM甘氨酸洗脱抗体。然后将抗体透析到PBS储存缓冲液中。过滤灭菌纯化的抗体，并用分光光度法测定蛋白质浓度。

细胞培养

HEK-293 T/17细胞在改良Eagle培养基(DMEM) (ThermoFisher scientific)中生长，该培养基补充有10%胎牛血清(FBS)(密理博Sigma)和100 IU青霉素-链霉素(ThermoFisher scientific)，在含5% CO22、37℃培养。使用含有5 mM EDTA的PBS(ultra pure，pH 8.0，ThermoFisher)收获HEK293T/17细胞，然后在室温下孵育5分钟。人骨肉瘤(HOS)细胞在补充了10% FBS、2% L-谷氨酰胺、2% MEM维生素、1%青霉素-链霉素(Gibco)和1%碳酸氢钠的基本培养基(MEM) (ThermoFisher)中生长，然后在37℃与5% CO₂一起孵育。使用胰蛋白酶-EDTA(0.25%)(ThermoFisher)消化细胞。

RAB2抗性病毒的产生

在我们以前的研究中描述了产生RABV抗性病毒的方法。简言之，小鼠神经母细胞瘤细胞第1天以1.5x10⁵/ml的细胞密度铺板。第2天，将1*10¹-10⁸ FFU/ml/孔的CVS-11与50μg/ml的RAB2在37℃孵育1小时。将病毒/RAB2混合制剂加入细胞并在37℃孵育。12小时后，用含有50 μg/ml RAB2的新鲜培养基更换细胞培养基。将细胞在37℃下再培养3天。在第5天，收获含有潜在抗性病毒的上清液，并在4℃下储存。将细胞固定并染色以进行RFFIT。从含有1-5个荧光灶的孔中取出的病毒在存在RAB2的情况下在MNA细胞上进一步扩增3天。从病毒感染的细胞中提取RNA用于RT-PCR和测序分析糖蛋白编码基因中的潜在突变。测序结果通过两次单独的感染/RNA制备来确认，以证实观察结果。

狂犬病毒ERA糖蛋白的克隆

    如前所述，对编码RABV Evelyn-Rokitnicki-Abel Seth(ERA)糖蛋白的基因序列进行密码子优化以用于哺乳动物表达。RABV糖蛋白全长表面蛋白(a.a . 1–524)的氨基酸(a . a .)序列及其可溶性片段(a . a 1–439)被克隆到表达载体pcDNA3.1Myc/His (ThermoFisher)中。蛋白质用myc/his标签在读框内表达。使用定点诱变产生丙氨酸扫描突变异株。使用含有所需点突变的重叠引物从先前克隆的密码子优化的ERA RABV糖蛋白扩增全长突变糖蛋白基因和pcDNA3.1Myc/His载体。根据制造商的建议(新英格兰生物实验室定点诱变试剂盒方案(E0554))选择PCR阳性克隆。

重组糖蛋白的表达和纯化

按照制造商的说明，使用1∶4的DNA-聚乙烯亚胺(PEI)(Sigma)比例将所有构建体转染到HEK-293 /17(ATCC)细胞中。细胞在150 mm组织培养皿中在30 mL DMEM-10%(FBS)(Sigma)中生长至95%汇合。将与120 μL PEI混合的30 μg DNA加入到细胞中，并且将平板在37℃下孵育过夜。对于分泌的可溶性蛋白，在转染后24小时、48小时和72小时移除并储存培养基，或者对于膜结合蛋白，丢弃培养基。

通过与镍-氨三乙酸(Ni–NTA)珠(ThermoFisher)一起温育2小时，然后使用10 mM咪唑洗去柱上的非特异性结合，并使用250 mM咪唑最终洗脱蛋白质，从细胞培养上清液中纯化含有Myc和他的表位标签的可溶性狂犬病糖蛋白。然后将洗脱的蛋白质在pH 7的PBS中透析2小时。

对RAB2的亲和力测定

使用具有Octet HTX (PALL/ForteBio)的生物层干涉测量法(BLI)来确定RAB2 IgG对ERA的可溶性糖蛋白的亲和力。在1000 nM下将RAB2加入96孔板中，并在PBS中以1∶2滴定至62 nM。纯化的RAB2抗体在333 nM下固定在抗人IgG Fc Capture (AHC)生物传感器(ForteBio)上120 s。在基线步骤之后，当具有固定化抗体的生物传感器暴露于不同浓度的ERA毒株糖蛋白120 s时，确定RAB2-抗原结合率。在结合步骤之后，将可溶性RAB2-ERA糖蛋白复合物暴露于PBS，并测量ERA糖蛋白从rab 2解离的速率。每个试验进行三次。RAB2对ERA糖蛋白的结合亲和力通过ForteBio数据分析软件v8.1 (PALL)使用结合和解离速率来计算。

细胞表面染色

用编码ERA全长野生型糖蛋白的构建体或单个丙氨酸突变异株转染HEK-293T/17细胞。转染后48小时收获细胞，并用不同浓度的HuMabs孵育。在流式细胞仪(MACSQuant)中通过藻红蛋白标记的抗人IgG (Jackson)检测人单抗与糖蛋白的结合活性，并用MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec)分析。

酶联免疫吸附检测技术

ELISA板用ERA可溶性糖蛋白(a . a . 1–439)包被。洗涤平板，然后用ELISA封闭缓冲液(EBB，PBS，1% BSA，0.05%吐温)。将抗体样品加入平板，然后在EBB中以1:2稀释。用与碱性磷酸酶(1∶500，Jackson ImmunoResearch)结合的山羊抗人IgG检测样品。用在1 M二乙醇胺(ThermoFisher)中的1 mg/mL的对硝基苯磷酸二钠盐将板显色20分钟，然后用Vmax板读数器(Molecular Devices)在405 nm下分析。

假型病毒的产生及中和试验

含有复制缺陷型慢病毒骨架(Env-，Vpr-HIV；HIV资源)与萤火虫荧光素酶基因pNL4-3融合。如前所述，使用PEI将Luc.R-E-与编码RABV糖蛋白ERA的质粒共转染到293 T细胞中。在转染后24小时更换培养基后，在转染后48-72小时收获假病毒颗粒，浓缩，并储存在-80℃。进行感染试验以确定假病毒制剂的每秒荧光素酶计数(cps)。感染后24小时，将培养基换成不含酚红的DMEM(ThermoFisher )，含10% FBS和1%青霉素-链霉素。使用Bright-Glo荧光素酶测定系统(Promega)在感染后72小时检测荧光素酶活性，并通过Victor3 de nivo多标记平板阅读器(PerkinElmer)进行分析。用大约50，000 cps的假病毒进行中和试验，并在室温下与从37 ng/ml开始的1∶5系列稀释的抗体混合制剂一起孵育1小时。然后将抗体/病毒悬浮液应用于HOS细胞(ATCC# CRL-1543 )，然后在37℃、5% CO2一起孵育。根据制造商的方案，使用Bright-Glo试剂(Promega)在感染后72小时测定荧光素酶活性。中和结果表示为基线荧光素酶活性的抑制百分比。

体外RABV RFFIT中和

快速荧光灶抑制试验(RFFIT)如前所述进行。将单克隆抗体稀释至标准起始浓度，然后连续稀释5倍。增加单克隆抗体的起始浓度，直到在稀释范围内检测到中和作用。将不同的RABV分离株或实验室毒株(包括CVS-11)加入到MAb稀释液中。根据经验确定每种病毒的起始浓度，以产生50x50%的荧光病灶剂量(50 FFD50)可接受的范围为32–100 FFD₅₀。对于每种病毒，测试2 IU/mL的标准狂犬病免疫球蛋白(SRIG，美国FDA lot R-3 )，大于150 IU/mL的HyperRab (HRIG，Grifols，Barcelona，Spain )，每种单克隆抗体，以及单克隆抗体成分的1:1混合制剂(鸡尾酒)。

在叙利亚仓鼠模型中的体内效力

实验方案在开始前由CDC的机构动物护理和使用委员会(#2622SMIHAMC-A18)批准，并严格遵守以确保动物福利。所有方法都是按照ARRIVE指南和规定(https://arriveguidelines.org)。四周大的雌性叙利亚仓鼠购自Charles River Laboratory(Wilmington，MA，USA)或Envigo (Indianapolis，IN，USA )，并根据所用的RABV变异株任意分配到包含12或21只动物的组中。在开始之前，动物经历了3天的检疫/适应期和兽医检查。在第0天，用异氟烷(3–5%)麻醉动物，并通过皮下注射预编程的被动集成应答器进行标记。仍然在麻醉状态下，对动物进行称重，使用锁骨下方法采集0.15 mL血液，并将0.1 mL RABV肌肉注射(IM)到左后腿的臀部区域。病毒滴定数据先前在具有各种分离毒株的仓鼠中测定。在未治疗组和单独接种疫苗组中，每一剂量都被滴定至导致80%以上的死亡率。攻击剂量和组大小如下:犬RABV变异株，TX coyote 323R， 103.5  MICLD50， n=12；狐狸 RABV分离毒株，AZ fox 2400L，8.6x10² ffu，n = 21；蝙蝠RABV变异株，PA bat EF A06-3684，1.4x10³ ffu，n = 21。每五分钟监测一次动物，直到它们从麻醉中完全恢复，然后每天监测一次，直到感染后7天(pi)。

PEP在24小时后开始，由作为阳性对照的20 IU/kg的HyperRab (HRIG，, Grifols, and Barcelona, Spain)组成。1.1 mg/kg的不相关的HuMAb用作阴性对照。将1.1 mg/kg的HuMAb鸡尾酒R172、0.1 mg/kg的R172或0.01 mg/kg的R172在与攻击病毒注射的同一条腿中进行肌肉注射。将0.05ml的Imovax狂犬病疫苗(Sanofi Pasteur，Lyon，France)在对侧腿中进行肌肉注射。一组没有接受任何PEP。对存活的动物在pi第4、8、15和29天(PEP第3、7、14和28天)重复施用狂犬病疫苗。在第4天和第8天(PEP的第3天和第7天)重复麻醉下的血液收集。每天对PEP注射部位进行评估，直到第8天出现任何局部反应。

从第7天到第21天，每天观察动物两次，并根据既定的安乐死标准，或主治兽医认为必要时，在出现狂犬病的第一个临床症状时，通过过量的异氟烷对动物实施安乐死。从第22天开始直到实验结束，每天观察动物一次。所有存活的动物在45天后被安乐死。

通过标准的直接荧光抗体(DFA)测试，对所有具有临床症状的被安乐死的动物和存活至第45天的大约一半的动物进行脑干中RABV抗原的测试。对于选定的动物，从脑干中提取RNA，并使用如前所述的LN34试验检测RABV RNA20或转化成cDNA用于RABV测序。从收集的血液中分离出血清，并用于在标准RFFIT中测量病毒中和抗体。

统计分析

使用graph pad Prism 8 . 1 . 1版(GraphPad Software，La Jolla，CA)进行所有统计计算。EC50 和IC50使用非线性回归分析通过s形曲线拟合计算值。使用Mantel-Cox检验从Kaplan-Meier曲线计算生存分析。p < 0.05 认为是有显著性差异。

数据可用性和方法声明

在当前研究期间生成和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。所有方法均按照相关指南和规定进行。

结果

北美狂犬病病毒分离株RAB1抗原表位分析

我们以前的工作鉴定了一种人单克隆抗体HuMab RAB1，它识别RABV糖蛋白上的构象表位，包括抗原位点III。发现残基336和346是RAB1与糖蛋白结合的最关键残基。为了进一步了解RAB1针对来自北美(包括加拿大和墨西哥)的RABV分离株的表位覆盖范围，分析了RABV分离株的总共553个糖蛋白序列，重点是两个表位残基a.a. 336和346(表1， S2).总体而言，包含氨基酸336-346的区域在所有分离株中高度保守。在残基336和346中发现的可变性如表所示1以及它们在快速荧光灶抑制试验(RFFIT)中的RAB1中和活性。在北美的陆生食肉动物分离毒株中，RAB1表位残基336在89%的总分离毒株中是天冬酰胺(N )，在11%的总分离毒株中是丝氨酸(S)。N336在346位与精氨酸(R，67%)或赖氨酸(K，22%)配对，S336与精氨酸(R，11%)配对。具有N336 R346、S336 R346和N336 K346的分离毒株在与EC的反应中均被RAB1中和50小于1 μg/ml的值(表1).

表1.北美狂犬病毒分离株的RAB1表位分析。共分析了553个序列，包括陆生和蝙蝠分离株。++EC₅₀<1 μg/mL.+EC₅₀>1 μg /mL.−在测试的最高浓度时未被HuMAb中和。aRAB1表位的Te出现频率，分别出现在336和346位。在RFFIT中检测具有明显表位变异的分离株。

在北美蝙蝠RABV分离株中，N336可以与精氨酸(R，74%)、赖氨酸(K，11%)、谷氨酸(E，7%)或丝氨酸(S，3%)配对，D336可以与346位的精氨酸(R，5%)配对。显示RAB1抗体中和大多数N336 E346分离株，但不中和树栖蝙蝠的分离株(表1).综上所述，我们的分析表明RAB1单独不足以覆盖北美RABV分离株的表位多样性。因此，需要一种抗体鸡尾酒。

作为鸡尾酒组分的附加HuMAb，RAB2的选择和表征

为了确定鸡尾酒的额外单克隆抗体，我们从先前选择RAB1的HuMAb组开始。我们从小组中选择了RAB2，第二强的HuMAb。为了理解RAB2的表位，在50 ug/ml RAB2存在下，使用CVS-11毒株产生抗性病毒。RAB2逃逸病毒的测序揭示了抗原位点II内33位(E33)的谷氨酸到赖氨酸的变化。为了证实这一发现并评估RAB2表位的其他残基，在抗原位点II的糖蛋白中引入了一系列丙氨酸残基，包括RABV ERA株的33-42位和198-200位(图1a)。  

来自丙氨酸扫描诱变的糖蛋白在HEK-293 T/17细胞表面表达，用荧光标记的RAB1和RAB2染色，并通过流式细胞仪分析。RAB1结合用于标准化蛋白质表达，以观察RAB2结合逃逸突变异株的情况。位置33被证实对于RAB2结合是关键的，但是没有一个其它相邻的残基显示对于RAB2结合是重要的(图1b)。与ERA E33K结合的RAB2(p= 0.001)和E33D(p= 0.0017)被破坏，如通过ELISA和流式细胞术所证实的(图1c)。通过使用抗人Fc捕获尖端的生物层干涉测量法，确定RAB2对ERA糖蛋白的KD亲和力值为37nM±2.4nM(图1d)。通过比较，先前确定RAB1对ERA糖蛋白的亲和力为KD = 2.82nM±0.5nM。

图1 RAB2和R172结合和中和狂犬病糖蛋白。（a)狂犬病糖蛋白示意图，显示了RAB1(抗原位点III)和RAB2(抗原位点II)的非重叠抗原位点位置，该图由BioRender.com创建。（b)抗原位点II丙氨酸突变异株的RAB2识别。ERA全长表面糖蛋白(a . a . 1–524)抗原位点II中的每个氨基酸通过定点突变被丙氨酸取代。（c)RAB2与野生型ERA439或RAB1逃逸N336D R346K和RAB2逃逸E33K突变异株的ELISA结合。（dRAB2抗体对野生型ERA439的亲和力测量，通过生物层干涉测量法进行。（e)R172与野生型ERA439或RAB1逃逸N336D R346K和RAB2逃逸E33K突变异株的ELISA结合。（f–h)针对带有野生型ERA糖蛋白的慢病毒的R172假病毒中和(f)，E33K(g)和N336D R346K(h)变异株人。ERA糖蛋白用作引入所有突变异株的骨架。使用Prism 8 . 1 . 1版通过非线性回归分析计算EC50值。数据绘制为n = 4次独立实验的平均值±标准差

R172结合和中和逃逸突变异株

上述表位分析表明，RAB2以高亲和力与不同于RAB1的抗原位点结合。然后在ELISA结合试验中针对RAB2逃逸突变异株E33K测试配制的RAB1和RAB2混合制剂(1∶1混合比，命名为R172)。此外，先前产生的实验室衍生的RAB1逃逸突变异株N336D R346K包括在分析中，以证明RAB2的交叉覆盖。发现R172混合制剂结合RAB1逃逸突变异株(N336D R346K)和RAB2逃逸突变异株(E33K)(图1e)与野生型水平相似(ERA439)。EC₅₀ R172 ELISA结合野生型的值为0.41 g/mL，E33K为0.35 μg/mL，N336D R346K为0.34 μg/mL(图1f)。

为了证实结合结果，进行了中和试验，测试RAB2抗含有E33K的RABVpp假病毒(图1g)或N336D R346K(图1h)。RABVpp由复制缺陷型HIV慢病毒骨架产生，该骨架被改造成含有RABV ERA糖蛋白。不相关的IgG1 HuMAb作为阴性对照。RAB2强力中和ERA野生型ERA (EC₅₀= 0.76 ng/ml)，ERA N336D R346K(EC₅₀= 2 pg/ml)而不是ERA E33K。相比之下，R172鸡尾酒对野生型ERA (EC₅₀)具有有效的中和活性= 0.22 ng/ml)，N336D R346K (EC₅₀= 3 pg/ml)和E33K(EC₅₀= 0.5 pg/ml)。

通过RFFIT体外中和R172的RABV

通过RFFIT进一步测试R172对抗在北美分离的30种RABV真实变异株，包括陆地和蝙蝠分离毒株。基于MAb表位的预测序列对病毒进行分组(表2和3)。对于陆地分离毒株，鉴定了三种表位变异株，包括E33 N336 R346 (ENR)、E33 N336 K346 (ENK)、E33 S336 R346 (ESR)和E33 D336 R346 (EDR)。R172以平均EC50中和所有陆地分离毒株，在低ng/mL范围内(表2， S1)。对于蝙蝠分离毒株，鉴定了更多的表位变异株，包括E33 N336 R346 (ENR)、E33 N336 K346 (ENK)、E33 N336 S346 (ENS)、E33 D336 R346 (EDR)和33D 336 N 346E (DNE)。R172能够在低ng/ml EC50范围内中和所有蝙蝠毒株，除了33D 336 N 346E (DNE)分离株。

    对于DNE分离株，RAB1用平均44 μg/mL EC₅₀中和，RAB2用平均500 μg/mL EC50中和，约高10倍，R172被平均60 μg/mL EC₅₀范围内中和(表格3， S1)。HRIG用于RFFIT分析中的比较。因为HRIG是多克隆产品，比较EC₅₀有问题。相反，50%终点滴度用于比较。通过HRIG中和不同表位类别的病毒大致遵循R172中和，因为HRIG对ENS、ENK、ENR、ed R和ESR病毒比对DNE分离株更有效。

表2 RAB1、RAB2和R172对北美陆地分离物的抗性。

++EC₅₀<1 μg/mL。+EC₅₀≥1 μg /mL。—在测试的最高浓度下不会被HuMAb中和。针对给定分离物的HRIG效价IU/mL。a在额外细胞培养传代后，在TKSK 5171中发现实验室获得性突变I338T。测试的主要野生型(wt)分离物。b在33、336和346位具有所述残基的表位变体。

在叙利亚仓鼠模型中的体内R172功效

为了评估R172的体内功效，用犬陆地变异株TX coyote 323R、狐狸分离毒株AZ Fox 2400L或蝙蝠分离毒株PA bat EF A06-3684 攻击仓鼠(RAB1和RAB2表位列于表中3)。24小时后，使用五剂狂犬病疫苗(第0、3、7、14、28天)以及不同剂量的HuMAb鸡尾酒R172或标准护理(20 IU/kg HRIG)或第0天的1.1 mg/kg无关HuMAb进行标准PEP给药。对于所有分离株，接受无关的人单抗和疫苗的组的存活曲线与未接受治疗的对照组没有显著差异(p分别= 0.92、0.68、0.12和0.15；图S1).

对于犬RABV变异株(TX coyote 323R)，1.1、0.1和0.01 mg/kg R172组的存活曲线与标准HRIG组无显著差异(p分别= 0.07，0.92，0.16)。对于狐狸分离毒株(AZ Fox 2400L)，1.1和0.1mg/kg R172组的存活曲线明显好于标准HRIG组(p= 0.01，0.014)，而0.01 mg/kg R172组与标准HRIG组(p= 0.064)，但明显好于无关的HuMAb组(p < 0.0001)。对蝙蝠分离毒株(PA bat EF A06-3684)，1.1 mg/kg R172组的存活曲线明显好于标准HRIG组(p= 0.001)。0.1 mg/kg R172组的存活曲线与标准HRIG组无显著差异(p= 0.1)，但明显好于无关的HuMAb组(p < 0.0001)。0.01 mg/kg R172 组的存活曲线明显好于标准HRIG组 (p= 0.038).

为了测试R172对抗难以中和的具有DNE表位的RABV分离株，表中列出了所有DNE分离株（表3）在13项挑战性研究中进行了测试。因此，DNE分离株不能用于评价R172的体内活性。

表3 RAB1、RAB2和R172对北美蝙蝠分离物的抗性。++EC₅₀<1 μg/mL。EC₅₀≥1 μg /mL。—在测试的最高浓度下不会被HuMAb中和。针对给定分离物的HRIG效价IU/mL。a细胞培养适应后在3860只蝙蝠中发现实验室获得性突变I338T。这种病毒的原始(野生型)分离物无法用于检测。b在33、336和346位具有所述残基的表位变体。

RAB1逃逸突变异株的体外CR57和R173结合和假病毒中和

鉴于R172对具有DNE表位的蝙蝠分离株的中和作用明显较差，并且无法在体内评估对这些变异株的保护作用，我们探索了使用先前描述的HuMAb (CR57)替代鸡尾酒中RAB2的可能性。如前所述，CR57是一种人单克隆抗体，对广谱RABV变异株具有良好的体外和体内中和效力。CR57抗体表位与RABV糖蛋白的抗原位点I结合(图2a)。在ELISA和假病毒中和试验中评估CR57和R173 (RAB1 + CR57，1∶1)对RAB1逃逸突变异株的作用。CR57 EC₅₀结合野生型ERA439与RAB1逸出N336D R346K 毒株相当，EC50值为0.0001 μg/ml(图2b)。R173结合野生型ERA439的EC50值为0.002 μg/mL和结合RAB1逃逸突变异株N336D R346K的EC₅₀值为0.005 μg/mL(图2c)。CR57和R173都能够完全中和野生型ERA439和N336D R346K与EC50范围在3到5 pg/ml之间(图2d，e)。

图2 CR57和R173结合和中和狂犬病糖蛋白。（a)狂犬病糖蛋白示意图，显示了RAB1(抗原位点III)和CR57(抗原位点I)的非重叠抗原位点位置，该图由BioRender.com创建。（b， c)CR57的ELISA结合(b)和R173(c)到了野生型时代439或RAB1逃逸突变异株N336D R346K。（d， e)针对带有野生型ERA糖蛋白的慢病毒的RAB1、CR57和R173的假病毒中和(d)和N336 R346K突变异株(e)EC₅₀值使用Prism 8 . 1 . 1版通过非线性回归分析计算数值。数据绘制为n = 4次独立实验的平均值±标准差。

RFFIT测定R173的体外中和活性

在RFFIT中，针对17种RABV变异株或实验室毒株筛选RAB1、CR57和R173。CR57强烈中和了具有DNE表位的病毒，包括北方蜡螟， 塞米诺尔蜗牛，以及灰翅蝗分离毒株具有平均EC50分别为0.033、0.103和0.036 μg/ml(表4和5， S1)。未被CR57中和的两个分离株被RAB1有效中和:AL bat (Tb变异株)和TX Skunk 4380(具有实验室获得的逃逸突变的中南部Skunk变异株)。另一个中南部的臭鼬变异株分离毒株(具有实验室获得的逃逸突变的TX臭鼬5171)被CR57中和，但不被RAB1中和。与以前的结果相似，用R173混合制剂中和每个分离株相当于混合制剂中最有效的HuMAb。总之，R173鸡尾酒强烈中和所有测试的RABV分离株，包括具有以前难以中和的DNE表位的病毒(表3和5， S1).Ln、Ps和Tb RABV变异株与公共卫生高度相关，因为美国过去30年的大多数人类狂犬病病例可归因于这些蝙蝠变异株。

讨论

狂犬病PEP的护理标准是在暴露当天注射RIG和狂犬病疫苗，然后在暴露后第3、7和14天注射一剂疫苗。RIG通常来自用狂犬病疫苗高度免疫的人类供体(HRIG)或高度免疫的马(ERIG)的混合血清。狂犬病人免疫球蛋白的及时管理至关重要，可以挽救生命。因此，对狂犬病人免疫球蛋白管理的任何挑战都会对公众健康构成威胁。有限的供应、高成本、批次间的可变性和理论上的病原体传播是寻求诸如单克隆抗体的替代品的主要原因。虽然从免疫的供体收集多克隆血清会产生针对许多中和和非中和表位的不同抗体库，但抗体技术的进步使得分离针对狂犬病糖蛋白上确定靶位的特异性单克隆抗体成为可能。RAB1是由我们的团队开发的全人抗体，由SII血清研究所许可，商品名为RABISHIELD©。RABISHIELD©是世界上第一个商业化的抗狂犬病单克隆抗体产品，并在印度获得人类PEP的完全许可。在印度，它被证明对RABV暴露是安全和有效的，在那里，北极样和印度次大陆的RABV变异株是狂犬病的主要来源。

RAB1能够中和大范围的陆地和蝙蝠分离毒株。RAB1被定位于抗原位点III，这很重要，因为抗原位点III通过病毒受体结合和病毒在神经系统中的传播在致病性中起主要作用。在抗原位点III的336和346位发现了RAB1逃逸突变异株。RAB1逃逸需要N336和R346突变。与印度不同，在北美，除了陆生食肉动物外，蝙蝠体内也有不同的RABV宿主。RAB1不能完全中和所有北美蝙蝠RABV分离株(表1)。因此，在混合制剂中需要额外的HuMAb和RAB1，以获得更广泛的中和活性。在这里，我们进行了一项研究，以确定和表征鸡尾酒中RAB1包含的额外HuMAb。我们从先前选择RAB1的HuMAb组开始，选择了RAB2，它显示了对几种RABV毒株的有效中和作用。RAB2表位与RAB1不重叠，并定位于抗原位点II。针对R172 (RAB1 + RAB2)混合制剂的RABV分离株的RFFIT测试揭示了具有D33 N336 E346 (DNE)表位的分离株在较低浓度下难以被R172中和，并且需要更多的抗体。值得注意的是，与所有其他受试变异株相比，还需要更高量的护理标准HRIG来中和效力低得多的DNE分离株。这一观察表明，HRIG的多克隆抗体混合制剂中可能含有少量的DNE特异性抗体。在仓鼠模型中，R172提供了与HRIG相当或更好的针对犬科变异株、狐分离株和蝙蝠变异株的保护。然而，在仓鼠模型中不能证明对DNE变异株的保护，因为当仓鼠被这些病毒攻击时缺乏死亡率。这些发现使我们发现了第二种非重叠抗体鸡尾酒，能够中和所有北美分离株，包括DNE变异株。先前由Dietzchold等人描述的CR57。21作为研究最多的抗狂犬病单克隆抗体之一。使用一组小糖蛋白肽通过ELISA结合来定义CR57表位36。发现CR57表位位于抗原位点I(a . a . 226–231，KLCGVL)内，其中四个残基K/C/G/V似乎对CR57结合至关重要36。像其他抗狂犬病单克隆抗体一样，CR57不能完全中和所有RABV分离株，包括在北美发现的一些分离株。在38个测试的街道RABV分离株中，CR57中和了RFFIT中的36个。未被中和的两个分离毒株是中南部臭鼬和来自鼠耳蝠的Ef RABV变异株。(科罗拉多州)。我们还发现，同样的中南部臭鼬分离株，有一个实验室获得的逃逸突变，没有被CR57中和。有趣的是，我们发现鼠耳蝠的Ef RABV变异株。(科罗拉多州)被中和，但一种以前被报道为被CR57中和的结核变异株在我们的研究中逃脱了中和。这将表明在阿拉巴马蝙蝠结核分离株中另一种可能的实验室获得性突变。然而，目前和以前报道的逃脱CR57中和的所有分离株都被RAB1完全中和(表4和5)，或者换句话说R173鸡尾酒。

正如世卫组织和FDA所强调的，在北美，需要一种单克隆抗体混合制剂作为HRIG的替代物，作为狂犬病PEP的一种成分。这些指南详细描述了美国单克隆抗体鸡尾酒的开发和许可的非临床和临床要求。我们的工作表明，R173，一种抗体混合制剂，可以中和本研究中测试的所有病毒，这代表了在对抗体结合重要的不同基因座检测到的遗传多样性。因此，R173有望中和北美的所有RABV变异株，包括测试的陆地和蝙蝠变异株。R173是进一步临床开发的有希望的候选者。

来源：Sci Rep. 2022 Jun 7;12(1):9403. doi: 10.1038/s41598-022-13527-0.A cocktail of human monoclonal antibodies broadly neutralizes North American rabies virus variants as a promising candidate for rabies post-exposure prophylaxis