福建省首例人源狂犬病病毒的分离鉴定及G基因序列分析

 【摘要】  目的 对2018 年福建省晋江一例疑似狂犬病病例进行实验室诊断。方法 对疑似病人唾液和脑脊液提取病毒RNA，而后用采用RT-PCR扩增病毒G基因序列，并用乳鼠颅内接种分离病毒。设计2对引物，分段扩增G基因序列后测序，运用 MEGA 5.05计算G基因核苷酸和氨基酸同源性，运用TOPALi V2.5软件构建NJ分子系统进化树，并与国内外疫苗株及福建省及相邻省分离的街毒株进行同源性分析。结果 确诊为狂犬病病人，新分离的街毒株命名为18FJ01，属基因Ⅰ型狂犬病病毒；系统发育分析表明，18FJ01株病毒与CTN 疫苗株同源性较高，与人用狂犬病疫苗PV 株、aG及兽用狂犬病疫苗ERA株和Flury疫苗株的同源性相对较远。结论 成功对泉州市2018年新发生的一例疑似狂犬病病例进行了病毒分离及鉴定, 新发现的毒株与 CTN 疫苗株同源性较高。

【关键词】 狂犬病病毒；街毒株；进化分析

     狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染引起的一种动物源性传染病，无有效的治疗手段，病死率几乎100%。狂犬病仍然是重要的全球公共卫生威胁，有100多个国家和地区有狂犬病流行，全球年死亡人数约59000人^{[1, 2]}。狂犬病主要发生在亚洲和非洲，亚洲的狂犬病病例数居全球首位，估计年死亡人数达30000人（95%CI,8100-61400），40%的狂犬病病人为不满15周岁的少年^[3]。目前，多个太平洋岛国无狂犬病报告，西欧、澳大利亚、加拿大、美国、韩国、日本和少数拉丁美洲国家报告消除了犬狂犬病^{[1, 4]}。

    狂犬病病毒属于单股负链病毒目（Mononegavirales）弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）。病毒颗粒呈子弹状，长100-300nm，直径为约75nm。病毒基因组为不分节段的单股负链RNA，编码5种结构蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和依赖RNA的RNA聚合酶（L）^[5]。G蛋白是唯一可以诱导机体产生保护性中和抗体的结构蛋白^[6]。

    本研究对来来自福建晋江一例可疑狂犬病病人进行了狂犬病实验室诊断，对分离的毒株进行了鉴定，同时对分离毒株的G基因进行了测序和分析，并与福建省及周边地区分离的街毒株以及国内外的疫苗株进行遗传特征差异和系统进化分析。

1.材料和方法

1.1 样品来源 

    2018年10月福建晋江市送检一例疑似狂犬病病人标本，其中10月14、15和16日分别采集一份唾液样本，唾液样本分别编号为18FJ01-T1、18FJ01-T2和18FJ01-T3；另外在10月16号采集了一份脑脊液和一份血液样本，分别编号为18FJ01-N1、18FJ01-X1。实验室将该疑似病人编号为18FJ01。

1.2 主要试剂 

    狂犬病病毒抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)由武汉生物制品研究所有限责任公司狂犬病检测中心提供。病毒 RNA抽提纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司,货号B518667-0100。逆转录试剂盒(PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）购自TaKaRa，货号6210A。Premix Taq 酶购自TaKaRa,货号RR902A。

1.3 实验动物 

    1-3日龄清洁级昆明小鼠,合格证号SCXK（鄂）2017-0013，No. 42000400006711由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物中心提供。

1.4 狂犬病病毒抗原的检测 

    用狂犬病病毒抗原检测试剂盒（双抗体夹心 ELISA 法）检测乳鼠脑组织悬液中的狂犬病病毒抗原，具体步骤参照文献^[7]。在阴性对照孔A450值<0.1，阳性对照A450值>0.5的条件下，以样品A450值>0.5判定为狂犬病病毒抗原阳性。

1.5 抗狂犬病病毒中和抗体检测  

    用快速免疫荧光灶抑制试验（RFFIT）检测血液中的中和抗体水平。将待检测血清在56℃处理30 min，将处理后待测血清和标准品用含10%小牛血清DMEM进行3倍系列稀释，即首先在96孔板中每孔加入100 μl DMEM，而后在第一孔加入50 μl待检测血清或者标准品，混匀后，取50 μl加入下一孔，每个样品稀释8-12个稀释度；而后在每孔中加入50 μl可以引起80% -95% BSR细胞感染的CVS病毒，同时设置空白对照孔（只加100 μl DMEM）和病毒对照孔，轻轻震荡后，96孔板置37℃ 5% CO2孵箱中孵育1 h，每孔再加入50 μl BSR细胞（1*10⁶个/mL）,再次轻轻震荡后，96孔板置37℃ 5% CO2孵箱中培养24 h，弃去培养液，加入100 μl/孔 0.1 M PBS缓冲液洗涤96孔板一次，而后加入-20℃预冷的80%丙酮（50 μl/孔），于4℃固定30 min；将固定后的丙酮甩掉，于超净台内进行干燥；每孔加入50 μl抗狂犬病病毒核蛋白荧光抗体染色液，于37℃孵箱孵育1 h；孵育后甩掉染色液，每孔加入100 μl PBS缓冲液洗涤3遍；生物安全柜内吹干后于荧光显微镜下进行观察计数。计算出致低于50％细胞感染的稀释度以及荧光面积百分比，以及高于50％细胞感染的的荧光面积百分比，通过Reed-Mueneh法计算ED₅₀,将标准品稀释为2 IU/mL用于试验，计算出样品中狂犬病毒中和抗体效价。以中和抗体效价大于0.5 IU／mL判为阳性。

1.6 乳鼠颅内接种试验

    用含青霉素( 500 U/mL )及链霉素(2 mg/mL) PBS(pH 7.4)溶液以体积比10%比例加入待接种唾液或脑脊液中，然后混匀。每份唾液或脑脊液颅内接种1-3日龄昆明乳鼠一窝，每只 10 μl，连续21 d观察乳鼠发病情况。将发病的鼠颈部脱臼处死，无菌取脑组织，于-70℃保存备用。1.7 病毒RNA的提取及G基因的扩增

    样品（唾液、脑脊液、鼠脑组织）经柱式病毒RNA抽提纯化试剂盒抽提病毒RNA,并使用逆转录试剂盒将病毒RNA逆转录成cDNA，逆转录所使用的引物为6核苷酸随机引物（N6）。使用Premix Taq酶对目的片段进行扩增，完整的G基因分为两段（G1和G2）进行扩增,G1用引物M13FM221/M13RG781得到1096 bp的产物；G2扩增使用引物M13RMSL2/ M13FL2得到1531 bp的产物，测序后将G1和G2拼接成完整G基因。G基因全长1575 bp，序列位于3316-4890之间。PCR所用引物见表 1。取 PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR 产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序引物用通用引物M13R（5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′）或M13F（5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′），引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物和测序所用引物Tab 1. Primers for PCR amplification and sequencing

M13R：5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′ M13F：5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′

M221: 5′-GGT GTA TCA ACA TGA ATT C-3′G781: 5′- CAT GTT CCG TCC ATA AG-3′

MSL2: 5′-TGG ATT TGT GGA TGA AAG AGG C-3′

L2: 5′- CCG GCT CCT GTT TGA TTC AGA G-3′

^a 引物位置基于狂犬病病毒PV株基因组序列.

1.8 DNA 序列分析 

    将本研究得到的序列和来自福建省及邻近的浙江省、广东省和江西省分离的狂犬病毒毒株、以及疫苗株组成一个分析的数据库，运行之前对序列相同但名称不同的毒株序列只取其中一个序列进行分析，最终共有41个序列用于分析。运用TOPALi V2.5（http://www.topali.org/）软件构建NJ分子系统进化树^[9]。用 MEGA 5.05 计算 G 基因核苷酸和氨基酸同源性^[10]。本研究中用于比较分析的狂犬病病毒 G基因序列来源于 GenBank，见表 2。 

表 2 本研究中参考的狂犬病街毒株及疫苗株 Tab 2. Rabies street strains and vaccine strains referenced in this study

 2.结果

2.1 RT-PCR鉴定

    对送检的唾液样品、脑脊液样品提取RAN,然后进行RT-PCR鉴定，见表3。对3个不同时间点采集的3份唾液样本用M13FM221/M13RG781这对引物扩增出特异性条带，但对脑脊液样品没有扩增出条带。

表3 样本 RT-PCR鉴定、颅内接种鉴定

Tab 3. RT-PCR and intracranial inoculation identification of samples

2.2 抗狂犬病病毒中和抗体检测  

   对送检的血液样本(18FJ01-X1)检测抗狂犬病病毒中和抗体为阴性。

2.3 病毒分离  

    将3份唾液和1份脑脊液样品于10月19日别进行乳鼠颅内接种，结果接种唾液样品的乳鼠在10天后（10月29日）发病，发病2-4天后乳鼠全部死亡。然而接种脑脊液样品的小鼠没有发病，存活超过1个月，而且在11月23日又出生一窝子代小鼠，未从中分离出病毒。

2.4 双抗体夹心ELISA检测狂犬病病毒抗原  

    取对发病死亡的4只乳鼠脑组织检测其A450值分别是0.523、0.525、 0.608和0.621，阳性对照0.698，阴性对照0.009，这也表明乳鼠脑组织病毒分离成功，进一步确定该病例为狂犬病病毒阳性。

2.5 G基因序列进化分析  

     对18FJ01 G基因序列与2008年分离于福建的5株街毒株，26株分离于浙江、江西和广东的街毒株，国际标准攻击毒株 CVS 以及 8 株疫苗株 G 基因序列进行比较分析。序列分析模型参数选择F84+Gamma，利用核苷酸构建G基因NJ进化树见图1，图中显示，目前分离于福建省的街毒株可以分为2个组，它们均属于基因1型狂犬病病毒。18FJ01这个新分离毒株在组1，与广东省分离株亲缘关系较近；它与1956年分离山东省的 CTN 株的亲缘关系最近，核苷酸和氨基酸同源性也最高；CVS株和除CTN疫苗株以外的7个疫苗株在同一个组。2008年在福建犬中分离的毒株属于组2。

图1狂犬病病毒G基因NJ进化树

Fig 1. Phyolgenetic tree predicted using a NJ algorithm based on rabies virus G gene sequences

2.6  G 基因序列同源性分析   

    G基因开放阅读框（ORF）全长1575 bp，编码524个氨基酸。18FJ01与浙江、江西和广东分离的街毒株G基因核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为84.3%-97.8%和92.9%-98.8%，与国内外人用疫苗株和兽用疫苗株核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为80.1%-93.2%和88.9%-96.9%。

    当前我国使用的人用狂犬病疫苗株有PV、PM、CTN、aG和HEP-Flury，兽用疫苗株ERA^{[7, 11]}。在此我们选取福建省两组代表性街毒株18FJ01和FJ015与当前我国使用的疫苗株PV、PM、CTN、aG、HEP-Flury 和 ERA 株作配对比较，核苷酸和氨基酸同源性见表 4。由表 4 配对比较显示：福建省代表街毒株与疫苗

株相比较核苷酸的同源性在79.6%和93.2%之间，氨基酸的同源性在 86.8%和 96.9%之间；同时我们发现无论在核苷酸还是氨基酸水平上，疫苗株 CTN 与福建代表街毒株间的差异要小于其它疫苗株和代表街毒株间的差异。

表 4 福建省代表性街毒株和疫苗株的比较

Tab 4. Pairwise comparison of the representative Fujian virus

strains and the vaccine strains

注：左下部的百分率是核苷酸序列的同源性，右上部是推导的氨基酸序列的同源性。

3 讨论

    近十余年来，我国狂犬病报告发病的最高峰为2007年，报告3300例^[12]，而后逐年下降，2018年狂犬病发病443例，较高峰下降86.6%。 2006-2010年福建省共报告狂犬病病例123 例，分别报道44 例、43例、15 例、12例和9 例，狂犬病年发病率呈现逐年下降趋势^[12]，近几年福建省几乎无狂犬病病例的报道。该病例是福建省首次经实验室确诊的狂犬病病例，该病例的确诊表明，福建省仍存在散发的狂犬病病例。对确诊后，建议对所有与病人有接触的医护人员进行了暴露前和暴露后免疫。

    该病人既往聋哑，是否有动物咬伤不详，突发脐周痛伴频繁呕吐1天，临床诊断为腹疼、肌痉挛、睡眠障碍、无明显诱因出现厌食，伴脐周痛，呈阵发性剧痛，呕吐胃内容物数次，伴发热，体温最高达38.5℃，有惊恐状。临床怀疑为病毒性脑炎、狂犬病、克雅氏病、破伤风和精神分裂症，最后经实验室多种方法确诊为狂犬病。如果病人近期没有明显的暴露使，临床没有出现恐风、恐光和恐水的典型症状，狂犬病通过临床来确诊比较困难，而且容易误诊，因此，对疑似狂犬病人必须通过实验室的分子生物学或者免疫学方法进行实验室检查是狂犬病确诊。

    狂犬病的临床实验室诊断有多种方法，包括RT-PCR、免疫荧光法、ELISA、乳鼠分离等多种方法。对唾液和脑脊液我们直接进行RT-PCR和乳鼠颅内接种检测；对发病小鼠用RT-PCR和ELISA检测。双抗夹心ELISA特别适合对脑组织的狂犬病诊断，具有敏感性高、操作简便等优点，可用于狂犬病的常规实验室诊断。徐葛林等人用免疫荧光法、免疫荧光阻断法、夹心ELISA和小鼠颅内接种法对102份脑组织进行检测，发现夹心ELISA与小鼠颅内接种试验相符^[14]。由于狂犬病人存在间歇性排毒，因此我们对多个时间点的唾液进行RT-PCR检测,避免出现漏检。本研究中，从唾液用RT-PCR和乳鼠颅内接种均检测出病毒，但脑脊液用两种方法均未检测出病毒。狂犬病人血液中和中抗体的检测也可以作为狂犬病的辅助诊断，但该病人血液中未检测出中和抗体。

从完整的G基因序列进化分析表明，目前福建省分离的RABV都属于基因Ⅰ型，可以分为两个组。张建明等人^[15]2008年从犬中分离的毒株可以放在一个组，而新分离的 18FJ01毒株放在另一个组，这表明他们起源可能不同。从G基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明，18FJ01与福建邻近省份核苷酸同源性至少有84.3%，氨基酸同源性至少有92.9%。所有福建街毒株G蛋白333位点都是Arg，Arg333对病毒的致病性是最关键AA残基^[16]，这也表明福建省目前分离的毒株都是强毒株。

    虽然福建省是狂犬病低发省份，但也有散在报道，从该确诊病例可知福建省仍是狂犬病的流行地区，有必要对福建省的狂犬病宿主动物、流行毒株进行进一步的分析，在更大范围内系统地开展福建省狂犬病的分子流行病学研究，分析流行毒株与疫苗株之间的关系、病毒株的变异情况以及毒株的起源和传播情况。

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