之所以Roger Tsien 实验室要花大力气产生不同颜色的荧光蛋白.又一个原因就是可以在同一个细胞同时观察不同蛋白的亚细胞定位.

在下图所示,由不同颜色荧光蛋白标记的细胞分裂过程.

modified from : figure 11

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/fpintroduction.html 

但是不同荧光蛋白(FP),如果激发光谱或者释放光谱很接近,就会导致leak though.比如打算拍绿色信号,但是红色信号也有一部分未被过滤.

本来小水獭简单地认为,就是因为倒U型曲线的覆盖.但是实际上,对于XFPs还有另外一个原因.

荧光蛋白的荧光集团形成需要好几个步骤,对于红色荧光蛋白DsRed而言,它的形成中有一个绿色态(green state).未成熟的DsRed可能会被激发而发绿色荧光.

对于绿色荧光蛋白GFP而言,它的光漂白(photobleaching)有一种情况就是在缺氧条件下,虽然激发光是488nm,GFP可能释放红色荧光.

荧光集团成熟过程如下图所示:

上图来源于 ChuDakov 2010 figure 6

这张图解释了我的一个疑问,就是荧光集团的成熟是否需要光激活,还是FPs在光激活以前荧光发色团已经形成.这张图中看来,有些荧光集团成熟好像是需要光子提供能量的,但是GFP是不需要的.

所以荧光蛋白的leak through 还是一个有多种原因的现象.

参考文献:

(1) Roger Tsien Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:509–44 The green fluorescence protein

(2)http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes.html

(3)Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA (2010) Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev 90:1103-1163.