博文
看得见的DNA测序
精选
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下午听了美国休斯顿大学生物与生物化学系杜晓春（Shiao-Chun（David） Tu）教授关于单分子实时DNA测序的报告，实时单分子DNA合成测序法（Single-Molecule Real-time DNA Squencing），觉得挺有趣，之前也听小鱼讲过类似的研究，所以感觉也比较熟悉。杜教授主要研究酶学，几十年来都致力于荧光、生物发光等研究，单分子DNA测序也是他工作的内容之一，在跟同事开公司的期间还取得了几项专利，现在公司已经被其他大公司购买，在单分子测序方面投入了更多的资金用于研发和推广。这篇博文主要是根据这次讲座整理的。
人类基因组计划的完成，让人们对于自身有了更多的认识，人类基因组由23条染色体，约30亿对核苷酸的DNA分子构成，其中1.5%（大约2-3万）为编码蛋白质的基因，此外还有很多非编码序列。分析基因组序列，对于认识各种基因的功能，了解基因表达的调控方式，理解生物进化的基础，进而阐明所有生命活动的分子基础无疑具有十分重要的意义。从基因水平深入理解疾病的发病机制，将为疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段，使个体化医疗成为现实。
DNA测序的发展有赖于基因工程技术的进步，1975-1985年的Sanger法可以称为第0代测序法，是DNA链末端合成终止法，基本原理是利用4种ddNTP代替dNTP作为底物进行DNA合成反应。一旦ddNTP掺入到DNA链中，由于核糖的3位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，因此反应终止。用放射性P或S标记dNTP，电泳分离片段，放射自显影，就可以读出一段DNA的序列。
1st Generation：1986-2006，Dye-terminator sequencer，荧光代替了同位素。
2rd Generation：2006-present，sequencing by sythesis。
3rd Generation：in 2-5years，real-time single molecule sequencing。
4th Generation：5-10？years，direct sequencing。
从最初的全基因组测序花费300million美元（比预算3billion少很多），到后来历时9个月花费30million，技术不断进步，成本也在逐渐降低，但是离人们期望的在1天之内甚至几小时之内完成3billion bp的测序花费在1k美元左右的目标还相差很远，传统的测序方法显然不能满足人们的需求。
目前比较新的sequencing technology主要有以下几种：
Approach Key steps
Ligation（SOLID） Hybridization+ligation/Amplification/Serial fluorescence
Base Extension Pyrosequencing/Amplification/Serial bioluminescense
SM Base Extension Nanopore conductivity
Dye on base fluorescence，ZMW
Dye on r-Pi/Real-time FRET
杜教授他们的研究是最后一种，应用FRET的方法，荧光标记在第三个磷酸分子上。FRET就是Fluorescence Resonance Energy Transfer （荧光共振能量转移），原理如图
FRET有两个条件：波长有重叠；合适的距离。energy transfer的efficiency与距离有关，如图
R。通常为20-40À。
杜教授他们应用的DNA测序方法是在DNA合成酶polymerase上标记donor，在第三个磷酸上标记acceptor，当标记了荧光的dNTP掺入到DNA分子中时，polymerase的donor把能力传递给dNTP的acceptor，donor的荧光强度降低，而acceptor的荧光强度升高，dNTP掺入后，Pi解离下来，所以不会影响下一个碱基掺入时的荧光变化，所以这种方法测序不用测一个就停下来，虽然目前由于技术限制故意放慢了DNA 合成的速度。现在正在研究试图利用多通道高通量的方法进行测序，那样就有可能在1天之内完成3billion的测序。他们现在的方法属于第2代、第3代测序方法，将来可能会出现直接测序，就是利用酶的构象变化conformational change直接测序，那样就不需要标记荧光，完全是在自然的情况下进行测序，会更简单更快速，当然技术要求也更高。
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