博文

转基因植物及其产品的检测技术

已有 10329 次阅读 2016-1-21 09:27 |个人分类:科学书摘|系统分类:观点评述

转基因作物自1996年开始商业化种植以来，全球转基因作物的种植面积已由1996年的170万hm²增加到2014年的1.815亿hm²，增加了106倍。面对全球转基因作物及其产业迅猛发展以及人们对转基因作物安全性的争论，世界各国纷纷加强对转基因作物及其产品的安全管理，制定相关法律法规，对转基因生物及其产品实行安全性评价和商品标识。

转基因作物及其产品的检测技术是转基因生物安全管理的基础和技术保障，随着转基因技术研究和应用的不断扩大，国际贸易日益频繁，引种交流力度加大，每年都涌现出大量新的转化体和新的加工品，只有通过准确检测和科学溯源，才能确保标识制度的实行，才能实现对转基因作物及其产品的有效监督和有力监管。

根据检测目的、检测对象和样品特点的不同，既可以对特定核酸序列和外源表达蛋白进行检测，也可以对转基因性状进行理化检测，还可以对外源基因转入后引起的代谢变化特征进行代谢检测。检测方法可以是定量检测或定性检测，检测技术可以是利用各类电泳技术、光谱技术、分析化验技术等。根据需要，可以在不同层面上对转基因植物及产品进行检测和评价。

一、核酸检测

目前，核酸检测技术是国内外转基因植物检测中应用最广泛的技术。该技术具有灵敏度高、适用性广、重复性好等特点，是当前国内外转基因检测的主流方法。核酸检测是以特定核酸序列为靶对象的DNA分析方法。转基因植物引入的外源DNA片段主要由通用调控元件、外源目的基因、转化载体序列和外源基因插入位点旁侧序列组成。因此，根据需要有4种检测策略可供选择：通用元件筛选检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系特异性检测。这几种核酸检测策略的侧重点和差异如下图所示。

4种转基因植物核酸检测策略重点和差异比较（李亚南等，2012）

核酸检测技术按照检测原理大体可分为核酸体外扩增技术和核酸分子杂交技术。前者主要指以PCR分析为核心的技术体系，是一种快速高效的检测方法，在转基因检测中得到了迅速的发展和广泛的应用。

基于PCR的核酸体外扩增技术

1971年，Khorana等就提出了核酸体外扩增的设想。1985年，美国PE-Centus公司的Kary Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应PCR技术，使核酸体外扩增的设想成为了现实。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，短时间内在一个反应体系中通过聚合酶的作用，将微量的靶标序列快速特异的扩增上百万倍，达到通过普通电泳就能识别的程度，快速简便，灵敏度高。非常适合于大批量的转基因产品的检测。经过近30年的发展，逐步成为国内外转基因植物及其产品检测中使用的常规技术。

定性PCR检测

通过定性PCR检测技术可以判断待检样品中是否含有转基因成分。主要有筛选检测和鉴定检测两种类型。筛选检测主要是针对包括启动子、终止子、筛选标记基因的检测。鉴定检测主要是针对目的基因（靶基因）进行的检测。

普通PCR检测。普通PCR反应包括3个基本步骤，即双链DNA模板高温下解链（变性）；在低温条件下两条寡核苷酸引物与单链模板DNA的目标序列进行碱基的互补配对，形成短的杂交链（退火）；在合适温度下，通过TaqDNA聚合酶作用使引物从5′端向3′延伸，伴随4种dNTP的选择性掺入，合成新的DNA互补链（延伸）。这样经过多轮循环反应后，目的DNA片段数量会随着循环数的增加呈现指数增长。一般纳克级的样本DNA经过30次左右的扩增即达到毫克量级，其灵敏度和精确度，比较适合转基因植物及其产品的筛选检测或鉴定检测。

巢氏PCR。巢氏PCR又称套式引物PCR，使用2对PCR引物（一对内引物和一对外引物）扩增目的片段。外引物PCR扩增与普通PCR扩增相似，内引物又称为巢氏引物，位于外引物扩增片段的内部。外引物扩增的产物成为内引物扩增时的模板，因此内引物扩增的片段长度短于外引物扩增的片段。这样经过巢氏PCR扩增后，PCR检测的灵敏度会大大提高，从而可以实现对微量样品的DNA的分析和检测。此外，巢氏PCR减少了引物非特异性退火，使得扩增特异性得到提高。因此，巢氏PCR对含量较低的转基因植物样品的检测十分有效，特别是深加工产品，比普通PCR方法的检测灵敏度可提高10倍以上。

多重PCR技术。多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，即在同一个PCR反应体系中加入2对或2对以上的引物用以同时扩增多个目标片段。这就要求引物与目标模板具有高度特异性，而且所有的引物应具有相近的熔解温度和相似的扩增效率，引物之间最好不发生相互作用；另外，扩增的目的片段大小也不能太接近，否则琼脂糖凝胶电泳时难以区分和辨别。多重PCR的优点就是通过一次PCR反应可以同时检测多个靶标基因，具有检测效率高、灵敏度高、工作量小、成本低等优点。Onishi等和James等建立的转基因玉米、大豆和油菜等的复合PCR检测方法，其灵敏度可达到0.1%。Germini等则建立了可同时检测5种转化体的7个不同目的基因的多重PCR方法，检测灵敏度介于0.06%～0.25%。

PCR-ELISA。PCR-ELISA是一种将PCR技术的高效性与酶联免疫吸附法的高特异性相结合的检测方法。即在聚合酶链式反应完成以后，用生物素标记的探针与诱捕在聚合酶链式反应管上的特异聚合酶链式反应产物杂交，再用碱性磷酸酯酶标记的链霉素进行ELISA反应。这种方法解决了聚合酶链式反应检测中非特异性干扰的问题，检测结果可直接通过酶标仪读取。与常规电泳方法检测PCR扩增产物相比，PCR-ELISA大大提高了检测的特异性和灵敏度，而且有利于同时处理大量样品，便于实现检测自动化。常规的PCR-ELISA技术只能作为一种定性检测，但若加入内标并作出标准曲线，也可实现半定量的检测。

PCR-GeneScan法。该方法是在PCR扩增后，借助DNA测序仪中基因片段扫描（GeneScan）的功能，替代常规的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测分析。该方法可以分辨出相差5～6个碱基的PCR产物，从而准确判定扩增片段的大小，减少结果的假阳性。

环介导的等温扩增技术。2000年，Notomi等建立了一种体外扩增特异DNA片段的新技术，称为环介导的等温扩增技术（Loop- mediated isothermal amplification, LAMP）。该技术的核心在于针对靶标序列的6个特异区域设计4条特异性引物，正向内侧引物FIP，正向外侧引物F3，反向内侧引物BIP，反向外侧引物B3，在60～65℃恒温条件下利用具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）催化新链合成，使靶标序列得到高效特异的扩增，整个扩增过程可在一小时内完成。最终扩增产物可通过凝胶电泳、荧光染料或扩增副产物焦磷酸镁沉淀进行结果判断。LAMP技术已在转基因检测领域得到应用，如用于检测转基因作物中CaMV35S启动子、NOS终止子、新霉素磷酸转移酶基因NPT II等，检测灵敏度可达到传统PCR方法的10倍以上。刘彩霞等针对RoundupReady转基因大豆及其加工品中外源基因EPSPS建立了LAMP检测方法，检测限可达到0.01%。虽然LAMP技术具有灵敏度高、特异性强、操作快速简单等优点，但是对引物设计要求较高，成为该技术推广应用的瓶颈所在。

LAMP引物设计原理（Chen等，2011）

依赖核酸序列的扩增技术。依赖核酸序列的扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification, NASBA）是在PCR基础上发展的以RNA为模板的快速恒温扩增技术，适宜于RNA分子检测。该技术主要利用到3种酶（AMV反转录酶、T7噬菌体RNA聚合酶、RNA酶H）和2条关键的寡核苷酸引物（上游引物5′末端含有噬菌体T7启动子序列，下游引物与目标序列相同，其5′端含有与钌标的电化学发光检测探针互补的序列）。NASBA扩增反应可在41℃恒温条件下进行，不需要特殊仪器设备，扩增效率比普通PCR更高、更灵敏，比常规PCR方法高1000倍。2008年，Morisset等将该技术与芯片杂交技术结合称为NAIMA（NASBA implemented microarray analysis），应用于转基因产品检测领域，可同时检测多个基因，适合未来大批量转基因检测。

NASBA技术工作原理（Polstra）

多重置换扩增。多重置换扩增（multiple displacement amplification, MDA）是近些年发展的一种基于全基因组扩增的新技术。该技术使用phi29DNA聚合酶和耐核酸外切酶活性的随机引物，在30℃恒温条件下即可实现环状DNA的恒温滚环扩增，也能够实现线性DNA的扩增，因此被称为多重置换扩增。与普通PCR相比，MDA对模板基因组DNA质量要求不高，即使未经纯化和含有PCR抑制物的微量样品也能做到全基因组均匀扩增，获得较高纯度的DNA产物。MDA扩增全基因组具有灵敏度高、保真性强、重现性好等优点，通过微量样本即可获得足够的DNA，并能反映出模板中不同序列的拷贝数差异。Roth等将MDA技术用于制备转基因检测标准物质，使得100 ng DNA增加了10倍，0.1ng DNA增加了2300倍，且偏移都在预期范围。

多重置换扩增技术原理(Lasken等，2003)

连接酶检测反应。1997年，Backman为检测靶基因序列中的点突变设计发明了连接酶链式反应（ligasechain reaction，LCR），该技术需要1对覆盖靶标序列的引物，与靶序列经退火结合，两条引物间留下一个缺口，由高温连接酶加入进行封闭，引物与靶序列间形成完整的互补链，实现线性扩增，每次反应产物都是下一轮反应的模板。当靶序列存在点突变时，连接反应则不能进行。LCR的检测效率与普通PCR相当，产物检测方便、灵敏，是目前检测已知序列中有无点突变的理想方法。Bordoni等报道了其检测应用效果，具有特异性强、效率高的特点。

定量PCR检测

随着各国有关转基因标识制度的建立和不断完善，对食品中的转基因成分含量的下限都有所规定，转基因植物及其产品检测的定量分析成为转基因标识制度实施的关键性监督保障。传统的定量PCR方法（如内参照法、竞争法和PCR-ELISA法）一直面临着两大难题：定量的准确度和PCR的假阳性污染。所有传统定量方法都是针对PCR终产物来进行的，而PCR的平台效应在一定程度上干扰了PCR的原始模板数量和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高；另一方面，用这些方法进行检测，都有赖于各种不同类型的PCR后处理过程，而这些处理过程很容易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中，可能造成PCR假阳性污染。

1996年，美国Applied Biosystems公司推出了实时荧光定量PCR技术。该技术的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR反应过程，通过对荧光信号的追踪从而实现对PCR起始模板定量的目的。其计算方式可采用与已知浓度建立的标准曲线比较获得，也可通过ΔΔCt比较法获得，相对误差较小。与传统方法不同，实时荧光PCR方法直接在管内检测，循环结束之后实时判断结果，不易造成污染且具有效率高、通量大、特异性强等优点。该方法一经建立，便在转基因定量检测方面显示了极大的优势。

根据荧光基团发光原理的不同，目前应用于荧光PCR检测体系的荧光探针主要有：TaqMan探针、分子信标、杂交探针（fluorescence resonance energy transfer, FRET）、荧光标记引物及SYBR Green I染料法，其中TaqMan探针法因特异性较高使用最为广泛。

TaqMan探针法。Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量，信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。淬灭基团也可采用自身没有荧光的非荧光淬灭基团，以降低本底信号对结果的干扰。

核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术是经典可靠的转基因植物检测技术。可以揭示外源基因的插入情况（如插入位置和插入拷贝数等），具有特异性强、灵敏度高的特点。但其操作流程复杂、检测周期长、成本高，对实验条件和人员要求较高。

Southern 印迹杂交技术（SouthernBlot）

英国科学家Southern于1975年创建了Southern印迹杂交技术。多年来一直是DNA特定序列检测的经典方法。其原理是基于具有一定同源性的两条核苷酸单链，在一定条件下会按照碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。如果将需要检测的靶序列的一段做成带有标记的（如同位素标记等）探针，将被检测的基因组经限制性内切酶消化成大小不同的DNA片段，电泳分离，变性后，原位转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，与标记探针进行杂交反应，洗去未配对结合的探针，检测膜上的特异结合的标记信号，确定目标物的有无。该方法虽然具有准确性高、特异性强的优点，但比较费时费力，而且样品需要量大，对DNA质量要求高，这些因素都制约了其在转基因植物检测中的应用。

Northern 印迹杂交技术（NorthernBlot）

NorthernBlot在1977年由美国斯坦福大学James Alwine等发明，它是通过检测目标RNA的方法来判定转基因的表达情况。其原理是在变性条件下将待检测的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，使得不同的RNA分子依据分子量大小进行分离，然后按照与Southern Blot相同的原理，进行转膜、杂交、洗膜，通过检测与特定基因互补配对的探针杂交信号，确定目标片段的有无。RNA极易降解，因此Northern Blot与Southern Blot相比，实验条件要求更为严格。

Northernblot可用来检测生物体不同发育阶段的组织、器官，以及胁迫条件或病理条件下特定基因的表达模式，进而说明转入基因的表达情况。

二、蛋白检测技术

酶联免疫吸附法

ELISA检测法就是将抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用偶联结合起来，根据酶作用于底物后的显色反应，借助于肉眼或仪器识别。ELISA检测既能做到定性检测，又能进行定量分析，且准确性高，特异性好。13个欧盟成员国和瑞典共37个实验室研究结果表明，大豆干粉中GMO含量为2%时，ELISA检测的可信度达99%。缺点是复杂的基质可能对它的准确性和精确度有干扰，许多存在于食物基质中的物质，如表面活性剂、酚化物、脂肪酸、内源磷酸（酯）酶，均可以抑制特异的抗原-抗体相互作用。此外，外源基因表达的蛋白质在较低水平时或加热处理变性时，其检测能力有所下降。还要注意的是某些导入基因的表达蛋白并不是在植物的所有组织中均有表达。

侧向流动型免疫测定

与ELISA相似，侧流型免疫测定也是基于三明治夹心式技术原理，但该法是在一种膜支持物上，标识的抗原-抗体复合物侧向迁移，直至遇到在一种固定表面上的新抗体（二抗）。目标蛋白一般是水溶的，且抗体具有高度专一性，样品仅需粗提便能达到测试的要求。因此，这种测定具有分析迅速的特点，可用于野外操作。免疫蛋白实验通常仅限于对植物叶片和种子的分析，因为抗体只识别没有变性的蛋白，但也有报道目前已能制备热变性后的蛋白抗体。

Western免疫印迹

在基因工程研究中，经常需要检测外源基因是否能表达，即转录的mRNA能否翻译出特异蛋白质。外源基因表达产物若是酶，可测定该酶活性；若表达产物不具酶活性，就要采用免疫学方法检测，一般采用Western?Blot。Western?Blot是植物基因工程研究中检测外源基因是否表达出目的蛋白的权威方法。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测对象是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western免疫印迹将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体，灵敏性较高，但操作繁琐、成本较高，不适合快速批量的检测。

试纸条法

试纸条法是将特异抗体交联到试纸条和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，再和带有颜色的特异抗体进行反应时，就形成了带有颜色的三明治结构，并且固定在试纸条上。该方法检测快速，具有一定的灵敏度，也能进行半定量，不需要特殊的仪器设备，适用于现场检测或初筛。

基于免疫技术的蛋白质检测方法在转基因检测的实际应用中因技术自身的局限性，在一定程度上限制其应用范围。主要原因有以下几点：①检测范围窄，一种商品化试剂盒通常针对特定转基因成分，对含有多种转基因成分的样品不能实现高通量和快速检测；②当蛋白表达量很低或转基因食品加工过程中蛋白质变性时，可能会导致与抗体不能结合，因此容易产生假阴性结果；③实验操作过程繁琐，不利于转基因产品批量检测；④实验过程中需要大量的抗体、抗原，检测成本高。

三、其他检测技术

近年来，利用现代物理、化学和生物技术建立的转基因植物及其产品检测新方法不断涌现，虽然有些仅处于研究阶段，但作为未来转基因检测领域的发展方向，具有不可忽视的价值和前景。

多光谱无损检测技术

多光谱成像技术是一种融合光谱信息和图像信息的无损检测技术，可同时获取对象的光谱和空间信息。被应用于农产品质量与安全检测，如农产品的污染物监测、缺陷识别、成分分析和品质评价。与常规的方法相比，该方法具有无损、快速、检测成本低、无污染等优点，无需进行任何样品预处理，还避免了人工评价和筛选中的人为因素干扰，结果更客观、准确，非常适合大批量的实时检测和质量控制。笔者探索将多光谱检测技术用于转基因植物及其产品的无损检测，取得了初步的成功。

技术流程如下：一是利用多光谱成像技术获取转基因和对应的非转基因作物种子的光谱信息和图像信息；二是将所获得的种子多光谱图像进行分析，得到种子的光谱特征和形态特征（包括面积、长宽比、色差值等）；三是将所获得的种子的光谱特征值和图像形态特征值进行数据的化学计量分析和建模，实现对转基因农作物种子的快速无损鉴别。在化学计量学方法中，如主成分分析、偏最小二乘判别分析和最小二乘支持向量机等分析法适合于转基因样品的批量数据分析。

转基因（□）与非转基因水稻种子（+）的主成分分析（liu等，2014）

基因芯片技术

基因芯片，又称DNA芯片（或DNA微阵列），是指将许多特定的核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地固定于支持物上形成的DNA分子阵列，然后与待测的荧光标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对其表面进行扫描，即可获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术，具有所需样品的用量极少、自动化程度高和被测目标DNA密度高的优点。目前基因芯片在实际检测中应用并不普遍，主要受一些因素的限制，如需要昂贵的检测杂交微弱信号的装置，芯片的制作、使用成本较高，需要具有对杂交信号及相关信息、数据的大规模处理和分析的能力。

国内外一些公司已生产了转基因产品检测基因芯片，我国首个转基因植物检测基因芯片在上海博星基因芯片技术公司诞生，用于检测转基因植物及其产品中常用的启动子、终止子、筛选基因、报告基因以及常见的目标基因（如抗虫、耐除草剂基因等）。基因芯片技术结合了PCR和分子杂交的优点，用量少，快速准确，而且一块芯片上可同时检测启动子、终止子、报告基因、抗性基因等，实现转基因产品的高通量检测，检测结果通过相关软件科学分析直接给出，更为准确可靠，因此在转基因检测领域具有广阔的应用前景。

毛细管凝胶电泳技术

毛细管凝胶电泳技术是近些年迅速发展的微分离分析手段，在高压电场的驱动下，以毛细管为分离通道，依据带电组分在电场中的迁移率不同而实现分离的技术。与传统的琼脂糖凝胶电泳技术相比，毛细管电泳的优势在于分离效率高、分辨能力强、样品需要量少、灵敏度和重现性好。特别是和荧光标记引物的多重PCR技术结合，可以满足未来转基因产品高通量、自动化的快速检测要求。也可以结合激光诱导荧光检测，发展出了具有灵敏度极高的激光诱导毛细管凝胶电泳检测方法,可达到0.01%的检测灵敏度，也可与竞争性定量PCR联用，实现转基因产品的定量检测分析。

生物传感器

生物传感器检测是利用将生物物质间特异的亲和作用转换成可识别的电信号或其他物理信号的装置，是一种将生物特性和电子装置结合的技术。核酸生物传感器是将核酸单链探针固定于传感器上，通过碱基互补的识别，将探针与靶标序列间的专一性结合转化成为可检测的信号。生物传感器的优点在于操作简便、快速实时、体积小，便于携带进行现场检测，特别适合于转基因植物及其产品的实时监控。目前，应用于转基因检测领域的生物传感器主要有光化学生物传感器、电化学生物传感器、压电式晶体管生物传感器等。

色谱技术

色谱技术的基本原理是利用待检样品混合物中各组分理化性质的差异，分配到互不相溶的两相。色谱分析由四部分组成：进样系统、色谱分离系统、检测系统和电脑分析系统。当转基因作物中的组分出现改变时，如蛋白质含量、油分含量、氨基酸组成、纤维结构等发生变化等，可以使用色谱技术进行精确分析和定量检测。

随着转基因植物商业化和产业化的不断加快，人们对转基因检测技术也不断提出新的要求。随着上述新技术研究的不断深入和成熟，必然会推动转基因检测技术向着高灵敏度、高特异性、高通量、低成本、无损化和自动化方向发展。