目前，世界能源结构仍然是以石油、煤炭和天然气等化石能源为基础。化石能源的可开采储量有限，其开采、运输和使用还产生严重的环境问题。能源短缺和环境污染，是人类社会可持续发展必须解决的重大问题，开发绿色、可再生新型能源，改变以化石能源为主体的能源结构是必由之路。氢能具有清洁、高效、可再生的特点，是一种极具发展潜力的化石燃料替代能源。与传统的热化学和电化学制氢技术相比，生物制氢技术具有能耗低、污染少等优势，受到人们的广泛关注。

生物制氢包括光合生物制氢和厌氧发酵制氢两大类，表1从产氢效率、底物转化效率等方面对各类生物制氢方法进行了总结。自从生物制氢技术研究开展以来，光合细菌一直备受关注，始终是生物能源领域的一个研究热点。利用光合细菌进行生物制氢，具有多方面的优点（刘冰峰，2009），如：①易培养，且可以多种废弃有机物为产氢原料，具有较高的理论转化率；②比蓝细菌和绿藻的吸收光谱范围更广泛，具有较高的光能转化潜力；③产氢需要克服的自由能较小（如利用乙酸产氢的自由能只有8.5kJ/mol H2）；④终产物氢气纯度可达95%以上；⑤产氢过程中不产生氧气；等等。然而，反应系统对光源的高度依赖性限制了光合细菌制氢技术的发展。为满足光合细菌产氢对光照强度和光照连续性的要求，一般采用消耗电能或其他化石能源的人工光源技术。而且，光合细菌在生长过程中产生的大量色素以及反应溶液本身的色度和浊度，会影响光在反应系统内的传播和分布，降低了光能的利用效率。这些不利因素，不仅使光发酵制氢工艺变得复杂，光反应器的放大困难，而且提升了制氢成本，技术的经济性尚待提高。

表1 几种生物制氢方法比较

有关光合法生物制氢技术的研究历史，要比暗发酵生物制氢技术更长，且至今热度不减。但其存在的问题也比较突出，如：①蓝细菌和绿藻在产氢的同时伴随O2 的释放，易使氢酶失活（杨素萍等，2003），而采用物理的和化学的方法消除O2，需要消耗大量惰性气体和能源；②光合产氢微生物只对特定波长的光线有吸收作用（Ida etal.，2002），而提供充分的特定波长的光照又会消耗大量能源，光源的维护与管理也变得复杂，规模化生产的难度很大（张全国等，2004）。

异养型厌氧发酵细菌的产氢，不依赖光照，纯菌种或混合菌群的培养都容易实现，其发酵工艺可以借鉴微生物发酵工业和有机废水厌氧生物处理的已有技术和经验，反应器的放大和控制更容易达到规模化生产的要求。而且，厌氧发酵细菌能利用多种有机物质作为制氢原料，可以取得清洁能源生产和污染防治的双重功效。所以，暗发酵制氢虽然起步较晚，但研究进展迅速。与光合法生物制氢相比，暗发酵生物制氢具有以下优势（任南琪，李建政，2003；任南琪等，2010）：①发酵产氢细菌的产氢能力要高于光合产氢细菌；②在实际培养中，发酵细菌的生长要快于光合细菌；③无需光照，反应装置的设计简单，操作管理方便；④反应器及工艺系统易于放大到规模化生产水平；⑤混合发酵菌群的驯化和反应系统的启动更容易；⑥原料分布广泛且易得，有利于降低制氢成本，具有更好的技术经济性。

暗发酵生物制氢技术由于具有可利用的原料丰富、产氢速率高、系统的运行稳定性好、较易实现规模化生产等优势，得到了广泛关注和研究，发展迅速。许多研究者在高效产氢菌种的选育、制氢反应器的设计与优化，以及采用分子生物学手段与基因工程技术改造产氢菌株的代谢途径等方面进行了研究，有效地提高了产氢系统的产氢效能，取得了一系列的成果，推动了生物制氢技术的发展。

为了实现纯菌种的持续产氢，发酵反应系统内必须维持一定的细胞密度。为此，人们探讨了以载体或包埋剂固定发酵细菌的细胞固定化技术（Yokoi et al.，1995）。Tanisho等（1994）以稀释糖蜜为底物，采用产气肠杆菌（E.aerogenes）E.82005 菌株进行了连续流非固定化游离细胞产氢试验。整个连续产氢试验持续了42 天，底物（以还原糖计）的最大H2 转化率为2.5 mol/mol，平均达到1.5 mol/mol。之后，他们（1995）采用聚氨基甲酸乙酯泡沫（polyurethane foam）对E.82005 菌株进行了固定，结果将底物的最大和平均H2 转化率分别提高到了3.5 mol/mol 和2.2 mol/mol。Yokoi 等（1997）在分批培养试验的基础上，对产气肠杆菌HO-39 菌株进行了系统的连续流培养产氢试验。在非固定化试验中，获得了120 mL/(L·h)的比产氢速率。当采用多孔玻璃做附载体对菌体进行固定化试验（反应器有效容积为100 mL）时，反应器的比产氢速率达到了850mL/(L·h)(HRT 1 h)，较非固定化细胞产氢率提高了7 倍。Rachman 等（1998）采用填充床式反应器（packdebed reactor），对E.aerogenes HU-101的变异株AY-2进行为期18 d的产氢测试，获得了31mmol/（L·h）的平均比产氢速率。Kumar 等（2000）以椰子壳纤维固定阴沟肠杆菌（E. cloacae）ⅡT-BT08 菌株，以葡萄糖为底物，在连续流稳定运行中，其最大比产氢速率高达62 mmol/(L·h)。

细胞固定化技术的使用，有效提高了反应器内的生物量，使单位反应器的比产氢速率和运行稳定性有了很大提高。但是，细胞固定化技术也存在明显不足（李建政，2001）：细胞包埋工艺比较复杂，且要求有与之相配套的菌种生产及菌体固定化材料的加工工艺，致使制氢成本大幅增加；细胞固定化形成的颗粒内部传质阻力较大，使细胞代谢产物在颗粒内积累而对生物的代谢作用产生反馈抑制和阻遏作用，从而会使生物产氢能力降低；包埋剂或其他基质的使用，势必会占据反应器的大量有效空间，使生物反应器的生物持有量受到限制，从而限制了反应器的比产氢速率和总产量的提高；固定化的细菌容易失活，一般经3～6 个月运行后需要更换，会进一步增加制氢成本。

与纯菌种培养相比，利用混合菌种，如厌氧活性污泥的产氢代谢制取H2，在许多方面表现出优势。如：①以混合菌种进行发酵产氢的系统，不存在杂菌污染问题；②厌氧发酵产氢活性污泥，能形成絮体，沉降性能好，可有效避免生物量的流失，保证系统的连续长期运行；③混合菌种利用的底物广泛，诸如工业有机废水、农作物秸秆、畜禽粪便以及餐厨垃圾等，经过一定的预处理均可作为发酵制氢的原料；④发酵系统易于放大到规模化水平，且操作简单，管理方便；等等。因此，基于混合发酵产氢菌群培养的厌氧发酵制氢技术更具商业前景（昌盛，2011）。

用于发酵制氢的混合菌种来源丰富，例如活性污泥、消化污泥、土壤、堆肥及禽畜粪便等（傅秀梅等，2007；郭婉茜等，2008）。然而，在这些菌种样品中，除发酵产氢菌群外，还生存着如产甲烷菌等不产芽孢的耗氢菌群。由于大多数发酵产氢菌，如梭状芽孢杆菌属等，具有产芽孢的特性，可以通过适当的污泥预处理措施，杀灭产甲烷菌，富集发酵产氢细菌。以活性污泥为例，常见的预处理方式有如下几种：①物理化学预处理，以热预处理方法最为常见。一般对接种物进行70～100℃、15 min 以上的干热或湿热处理，可有效灭活不产芽孢的真细菌和产甲烷菌，使产芽孢的发酵产氢菌得到富集（Lay etal.，1999；Cheong&Hansen，2006）。以热处理后的活性污泥、厌氧消化污泥、牛粪、堆肥及土壤等为接种物，可以显著提升发酵制氢系统的产氢效能（Lin &Chou，2004；Zuoetal.，2005；Cheong & Hansen，2006）。基于产甲烷菌对环境pH 适应范围狭窄的特点，也可采用酸处理或碱处理的方法富集发酵产氢菌，预处理的pH 一般选择3 或10。经过酸碱预处理的接种物，可显著提升混合菌群的发酵产氢能力（Chang et al.，2002；Chenetal.，2002；Wu et al.，2003；Lee et al.，2004）。②曝气预处理，即采用曝气培养的方法，抑制产甲烷菌的活性，并提高诸如Enterobacter 等兼性厌氧产氢菌的数量（Ueno et al.，2001 a）。利用这一方法对堆肥（Ueno et al.，2001a；1995；1996；2001b）、好氧活性污泥（Renet al.，2008）和厌氧消化污泥（Zhu & Beland，2006）进行处理均能获得很好的效果。③投加产甲烷菌特异性抑制剂。即在厌氧发酵制氢系统中，通过一定方式投加产甲烷菌特异性抑制剂，达到抑制产甲烷、促进发酵产氢的目的。研究表明，溴尿嘧啶酸（bromoethanesulfonic acid，BESA）、乙炔、氯仿等均可作为产甲烷菌的特异性抑制剂（Gunsalus et al.，1978；Sprott et al.，1982；Chidthaisong&Conrad，2000；Scholten etal.，2000；Wang J L & Wang W，2008）。值得注意的是，对于同一接种物，预处理的方法不同，其效果存在较大差异（郭婉茜等，2009；Cheong & Hansen，2006；Hu & Chen，2007；Mu et al.，2007；Mohanetal.，2008）。所以，接种物的预处理方法，需要根据接种物的来源和特点进行比较和选择。

在发酵制氢工艺方面，采用间歇式发酵反应装置、半连续流及连续流反应器进行发酵产氢的研究均有报道。一般而言，序批式发酵反应器获得的产氢速率要低于半连续流和连续流发酵制氢反应器。在连续流发酵制氢工艺中，除了被广泛采用的完全混合型连续流搅拌槽式反应器（continuous flow stired-tank reactor，CSTR）外（Younesi et al.，2008；Dinget al.，2010），诸如厌氧序批式反应器（Bhaskaretal.，2008；Buitron&Carvajal，2010）、膜分离反应器（Oh et al.，2004；Li & Fang，2007）、固定床反应器（Palazzi et al.，2000；Changet al.，2002；Show et al.，2011）、升流式厌氧颗粒污泥床（upflow anaerobic sludgeblanket，UASB）（Chang & Lin，2004；Lo et al.，2009a）、厌氧折流板反应器（anaerobic baffledreactor，ABR）（鲍立新等，2007；李建政，任南琪，2010；Liet al.，2007；Zhu et al.，2012）、厌氧流化床（anaerobicfluidized bed，AFB）（Zhang Z P et al.，2007；Lin et al.，2009）、膨胀颗粒污泥床（expanded granule sludge bed，EGSB）（王相晶，2003；郭婉茜，2008）等都能用作发酵制氢反应器。

要想实现规模化生产，寻求利用率高且廉价的发酵基质，以降低H2 生产成本，是必须解决的一个问题。大量研究表明，单糖、双糖及淀粉等碳水化合物是发酵生物制氢的理想原料（Antonopoulouetal.，2007；Lo et al.，2008；Lo etal.，2009b；Luo et al.，2011）。如木质纤维素和活性污泥等，其成分复杂，大多是结构复杂的高分子有机物，用于发酵制氢时，系统的稳定性差，持续产氢困难，产氢效率也较低（Okamoto et al.，2000；Ginkelet al.，2005）。通过一定的预处理，这些复杂的底物会变得较易被发酵产氢菌利用而使其产氢效率大幅提升（Zhang M L et al.，2007；Luo et al.，2010）。以复杂的作物秸秆、餐厨垃圾、市政垃圾、市政污泥及禽畜粪便等为底物，进行发酵产氢的研究均有报道（Antonopoulouetal.，2007；Kim & Lee，2010；Juanget al.，2011）。利用这些组成复杂，但富含单糖、淀粉、纤维素等的废弃生物质为原料进行发酵制氢，既可以获得洁净能源，又可以治理污染，具有良好的经济效益、环境效益和社会效益（Antonopoulouetal.，2007）。

目前的发酵法生物制氢，其基本原理均是利用产酸发酵细菌的产酸发酵作用（Levin et al.，2004；Erogluet al.，2006），单位基质的H2 转化率很低（葡萄糖仅为2 mol/mol 左右），原料中的大部分氢元素仍被固定在诸如丙酸、丁酸、乳酸和乙醇等发酵产物中，如何突破生物质暗发酵产氢的代谢障碍，提高单位基质的H2 转化率，已成为制约发酵生物制氢技术工业化进程的瓶颈，是降低制氢成本的关键。暗发酵过程产生的有机会发酸（VFAs）可被光合细菌利用并进一步释放出H2。所以，将暗发酵和光发酵组合，能有效提高基质的H2 转化率（Lee et al.，2008；Yang et al.，2010）。Su等（2010）采用暗发酵和光发酵的组合工艺，以水葫芦为底物进行了产氢试验，通过暗发酵和光发酵对底物实现梯级利用，水葫芦（以干重计）的最高比产氢量达到了0.5961 m3/kg。Liu 等（2009）采用产乙醇杆菌属（Ethanoligenens）的哈尔滨产乙醇杆菌（E. harbinense）B49 菌株和光发酵细菌R.faecalis RLD-53 的组合培养方式，提高了基质的比产氢量。经过E. harbinense B49 和R. faecalis RLD-53 两步代谢，葡萄糖的H2 转化率最大可以达到6.32 mol H2/mol葡萄糖。这些研究成果表明，通过产酸发酵菌和光合细菌的联合作用，可以大幅度提高基质的H2 转化率，是解决发酵法生物制氢存在的生物质H2 转化率低这一问题的有效方法。

微生物电解池（microbial electrolysis cell，MEC）在外加电压下，能将如葡萄糖、乙酸、丁酸等有机物转化而放出H2（Kyazze et al.，2010）。因此，MEC 也可以与暗发酵相结合，对有机废物进行梯级利用，而增加基质的H2 转化率。Lalaurette 等（2009）以木质纤维材料为底物，采用热纤梭菌（C.thermocellum）作为暗发酵菌种并和MEC 相结合，获得了较高的H2 产量，葡萄糖的H2 转化率高达9.95mol H2/mol 葡萄糖。Lu 等（2009）以连续流乙醇型发酵制氢反应器的出水为底物，利用MEC 制氢，比产氢速率可达1.41m3/(m3·d)；厌氧发酵制氢系统和MEC 组合时，氢回收率和比产氢速率分别可达96%和2.11m3/(m3·d)左右。

然而，基于上述两种耦合方式实现生物质梯级利用的产氢技术研究，目前尚处于实验室探索阶段，无论技术的成熟度还是生产规模，都远远不能满足商业化生产的要求，但其发展前景应给予充分重视。

我国的发酵法生物制氢技术研究起步于20 世纪90 年代，但进展迅速。早在1990年，笔者就提出了以厌氧活性污泥培养为基础的、以有机废水为原料的发酵法生物制氢技术思想，并开展了持续研究。1992年完成了连续流有机废水发酵法生物制氢小试研究，在CSTR 中获得了10.4～11.4 m3/(m3·d)的产氢能力（任南琪，王宝贞，1994）。该法避免了利用纯菌种进行生物制氢所必需的纯菌分离、扩大培养、接种与固定化等一系列配套技术和设备，在大幅度降低生物制氢成本的同时，也提高了生产工艺的可操作性，在技术上更易满足工业化生产的要求。1999 年，课题组完成了世界首例有机废水发酵法生物制氢技术中试研究，有效容积为1.48m3 的CSTR 制氢反应器连续运行了200 多天，最大比产氢速率达到5.57 m3/(m3·d)，厌氧活性污泥［以混合液挥发性悬浮固体（mixed liquorvolatilesuspended solid，MLVSS）计］的比产氢速率为0.75 m3/(kg·d)，去除COD的产氢率达26.13 mol/kgCOD（Ren et al.，2006）。目前关于生物制氢中试规模的研究非常有限。据报道（Kumar &Das，2001），印度理工学院采用固定阴沟肠杆菌IIT-BT 08 菌株的方法，在容积为800 L 的生物反应器中获得了77.3 mmol/(L·h)的比产氢速率。2002～2005 年，笔者课题组建设并完成了发酵法生物制氢技术生产性实验，成功将该技术推进到了规模化生产水平。有效容积为63.5 m3 的CSTR 反应器，每天可产生280 m3左右的H2，纯化后的氢气纯度达99%以上。

在20 多年的研究历程中，课题组在发酵法生物技术研究中不断取得进展，如：①开发出以厌氧活性污泥混合菌群为H2 生产者的制氢技术；②发现了产氢能力很高的（细菌性）乙醇型发酵类型，其H2 产率比国外广泛研究的丁酸型发酵高几十倍；③发明了高效连续流生物制氢反应器，并成功发展到中试和规模化生产水平；④对生物产氢发酵的生物物理化学、群落生态学、生理生态学、发酵动力学等进行了广泛而深入的研究，推进了生物产氢-产酸发酵理论的发展；⑤研发出了发酵类型的定向调控技术，提出了最佳工程控制对策；⑥在世界上首次完成中试研究，并开发出生物制氢成套工艺和设备；⑦通过有机废水发酵法生物制氢技术生产性示范工程研究，将发酵法生物制氢技术推进到了规模化生产水平；等等。《发酵法生物制氢原理与技术》将较为全面和系统地总结和介绍课题组的上述研究成果。

发酵法生物制氢原理与技术

任南琪，李建政 著

城市水资源与水环境国家重点实验室优秀成果

ISBN 978-7-03-054881-8

责任编辑：朱 丽 杨新改

《发酵法生物制氢原理与技术》以发酵法生物制氢理论研究和技术创新为主线，系统总结了任南琪教授及其团队30 余年来在发酵法生物制氢领域取得的理论与技术成果。在阐述生物制氢技术基本理论和研究现状基础上，重点介绍了发酵产氢菌种资源开发，发酵产氢细菌的生理生态学和分子生物学机制，发酵产氢微生物的生态学以及群落演替的定向调控策略，代表性发酵制氢设备CSTR 的研制、调控运行、化学与生物强化技术，以及在此基础上开展的中试研究和规模化生产试验等成果，并分析了技术发展面临的瓶颈和关键科学问题，介绍了问题解决的思路和探索性研究成果。本书可供资源与环境、环境科学与工程、资源管理与开发以及微生物等专业的科技工作者、研究生和管理者等参考。

（本期编辑：王芳）