关于第三代测序仪，或者说“下下代测序仪”（Next-Next-generation sequencing）的定义还没有一个全面的共识。因为技术的发展和进步是如此之快，以至于新出现的技术不容易按照“代”来划分。在这里，我综合了国内外测序领域的一些观点，尝试着为第三代测序来做一个定义。

第三代测序技术最直接的定义为：单分子测序技术。按照这个定义，Helicos Biosciences（单分子测序技术）是刚刚进入三代测序门槛的技术。Pacific Biosciences（单分子实时测序）是正统的三代测序仪. ZS Genetics 和 Oxford Nanopore 等纳米孔单分子测序技术则是更加革命性的三代测序技术甚至是第四代技术。

第三代测序技术相对二代测序技术的“质”的提高包括：

1，  第三代测序技术不需要PCR扩展，消除了潜在的扩展错误和不均匀。

2，  可以直接阅读RNA的序列。例如：Helicos直接使用RNA反转录酶，边RNA反转录合成边测序。

3，  可以直接阅读包括甲基化在内的DNA修饰。例如：Pacbio使用甲基化和非甲基化碱基的合成速率上的差异来进行区分。

第三代测序技术相对二代测序技术的“量”的提高包括：

1，  第三代测序仪测得更长。PacBio系统可以测到1000bp以上。

2，  第三代测序仪测得更快。

以上列的“量”的提高，是一个相对的优势。二代测序技术发展很快，测序变得越来越长，越来越快。比如说Illumina测序仪在2007年的时候只能测序50bp，现在已经可以测300bp了。Illumina的Hiseq测序需要一周的时间，而如今的Miseq测序只需要10个小时就可以完成了。我们完全可以想象，假以时日，二代测序未来可以测到1000bp，以及1小时内完成测序。因此，测序长度和测序时间不能作为区分三代和二代技术的标准。

测序技术发展很快，未来必然会出现四代，五代测序技术。虽然更多技术的出现，我们会对技术分代有个更加清晰的认识。

后记(2014.10.21)：在目睹了英国牛津纳米孔测序仪的运行之后，我个人认为纳米孔测序应该定义为第四代测序，其特征为：对DNA进行直接观测测序，不需要进行双链合成。

参考文献：

https://www.iths.org/sites/www.iths.org/files/eventmedia/ITHS_ThirdGenerationSequencers.pdf

http://hmg.oxfordjournals.org/content/19/R2/R227.full

参考网站：www.directgenomics.com