背景介绍

虽然关于R蛋白介导植物免疫的研究已经很多，但是鉴定到的R蛋白下游直接信号分子很少，因此我们对于R蛋白介导植物免疫的分子机制知之甚少。

在前期研究中发现，GTPase OsRac1参与了植物免疫过程，并且鉴定到了一个R蛋白Pit和OsRac1互作。Pit参与了水稻对稻瘟病的免疫过程。OsRac1位于Pit的下游，影响ROS的产生和细胞死亡。并且OsRac1的膜定位是激活OsRac1必须的。

科学问题

OsRac1没有GEF domain，它是如何激活OsRac1的呢？

主要结论

1.OsSPK1和Pit互作

已有研究表明GEFs促进GDP从GTPase上解离，是GTPase的激活因子。在前期研究中发现两种GEFs（OsRacGEF1和OsSWAP70）参与OsRac1介导的植物免疫。

问题：OsRacGEF1和OsSWAP70是否与Pit互作，参与了Pit介导的激活OsRac1的过程？

酵母双杂显示，Pit并不与OsRacGEF1，OsSWAP70互作，但是和另外一个GEFs OsSPK1互作。Pit N端的CC domain和OsSPK1的C端互作，并使用Co-IP（瞬时转化烟草），Pull-down以及BiFC实验进一步验证。

2.OsSPK1参与了Pit介导的植物免疫

问题：OsSPK1和Pit互作，它是否参与了Pit介导的植物免疫过程？

使用RNAi方法降低OsSPK1的表达，Pit介导的植物免疫降低。

3.OsSPK1作为OsRac1的GEF发挥作用

问题：OsSPK1含有典型的GEF domain，它是否可以激活GTPase OsRac1？

先通过酵母双杂检测OsSPK1是否可以和OsRac1直接互作，发现OsSPK1的C端可以和OsRac1互作，并通过Co-IP和Pull-down进行了验证。

体外生化试验表明：OsSPK1 C端可促进OsRac1释放ADP。并且OsSPK1 RNAi株系中，Pit诱导的OsRac1活化程度降低，说明Pit诱导的OsRac1活化依赖于OsSPK1 。

4.Pit的CC domain是和OsSPK1互作，介导OsRac1激活以及植物免疫必需的

技术方法

Take Home Message

R蛋白的表达量通常会比较低，有时在原生质体中的表达量也不高，可以像本文中的那样，在烟草叶片中瞬时表达，这样可以收集到较多的样品，再进行蛋白富集，以得到更多的蛋白。