在前面的讲解中，我们介绍了乙烯信号转导通路中的两大组分：乙烯受体家族和CTR1。和大多数植物激素信号通路不同，乙烯信号中起始的这两大组分“狼狈为奸”，共同把持着乙烯信号通路的命脉，抑制信号向下游的传递。不过，“天理昭昭，报应不爽，邪恶终归抵不过正义”。大自然这位伟大的编剧，巧妙地安排了一位“少年英雄”替天行道、除恶扬善，把邪恶消亡，让正义永存。这位英雄就是我们今天的主角，“伟光正”的EIN2。

在《乙烯反应突变体的筛选》一文中，我们曾提到过，1990年Ecker课题组在The Plant Cell上发表的系统阐述以拟南芥三重反应为模式，进行乙烯反应突变体筛选的文章中，筛选到了一个乙烯不敏感突变体，在高浓度乙烯存在的情况下仍然不出现三重反应，这就是第一个EIN2（Ethylene Insensitive 2）等位突变体ein2-1。

1999年，Ecker实验室在Science上发表题为EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis的文章。文章中总结，在后续的遗传筛选中，陆续筛选出了25个ein2等位突变体。在这些突变体中，除了ein2-9，其他24个突变体在形态学、生理学以及分子水平都对乙烯处理不敏感。此外，它们除了对外源乙烯处理不敏感外，对内源乙烯也完全不敏感，并且在拟南芥的各个生长时期都有表型，这就说明了EIN2在乙烯信号通路中起到非常关键的作用。

有意思的是，除了在筛选乙烯不敏感突变体的过程中筛选到ein2等位突变外，在筛选生长素转运抑制剂、细胞分裂素和ABA不敏感突变体，以及衰老延缓突变体的过程中，也都筛选到了ein2等位突变，但是并没有筛选到其他乙烯信号通路的组分，这说明EIN2可能特异地介导了乙烯和其他激素的互作。

   ein2突变体对乙烯不敏感【2】

通过图位克隆将EIN2定位在5号染色体的头部，并进一步克隆到EIN2基因。通过杂交实验发现EIN2在拟南芥基因组中为单拷贝，这可在一定程度上解释为什么唯独EIN2突变会导致拟南芥对乙烯完全不敏感。Northern blot发现EIN2在拟南芥的根、茎、叶以及花中都有表达，但是mRNA水平不受乙烯的影响。对25个ein2等位突变体中的EIN2进行测序后发现，它们中的EIN2基因都存在不同的突变。将野生型的EIN2转化至ein2-5中，可以互补突变体的表型，说明突变体的乙烯不敏感表型确实是由于EIN2基因的突变导致，并且EIN2在乙烯的信号转导中发挥正调控作用，这是我们迄今为止讲到的第一个在乙烯信号通路中起正向作用的组分。

EIN2的图位克隆及等位突变【2】

将EIN2基因组和cDNA序列比对后发现，EIN2含有7个内含子。EIN2基因编码1294个氨基酸，蛋白大小约为141kD。N端的461个氨基酸具有非常强的疏水性，而C端的833个氨基酸却具有非常高的亲水性。蛋白结构预测发现EIN2蛋白具有12个跨膜结构域，全部位于N端。进一步通过体外实验证明，EIN2蛋白确实具有完整的膜定位。蛋白序列比对后发现EIN2的N端和Nramp家族蛋白具有较高的序列相似性（21% identity）。Nramp家族蛋白在细菌到人类的所有生物中都有发现，主要起到转运二价金属离子的作用。但是，将EIN2蛋白在爪蟾卵母细胞、酵母等系统中表达，并没检测到离子转运的活性，说明EIN2并不具有离子转运的功能，可能通过其他的机制行使功能。

EIN2 N端与Nramp蛋白序列比对（箭头所示为12个跨膜结构域）【2】

按照一般的理解，既然EIN2在乙烯的信号转导中起正调控的作用，如果将EIN2过表达，拟南芥应该会表现出组成型乙烯反应或者乙烯过敏感的表型。可是，将EIN2的N端和全长过表达，并没有出现上述表型。但是将EIN2的C端（CEND）在ein2-5中过表达，却可导致光下生长的幼苗出现组成型乙烯反应，并可持续激活乙烯响应基因的表达。以上结果说明，EIN2的Nramp-like domain可能通过某种机制调控CEND的功能。

将EIN2 CEND在ein2-5中过表达，导致光下生长幼苗出现组成型乙烯反应【2】

2009年， Georg GROTH实验室在Biochemical Journal上发表题为EIN2, the central regulator of ethylene signalling, is localized at the ER membrane where it interacts with the ethylene receptor ETR1的文章。他们将EIN2-GFP融合蛋白在烟草叶片中瞬时表达，并通过激光共聚焦显微镜观察，发现EIN2-GFP和ER的marker蛋白共定位，并在细胞核周围表现出典型的ER网状结构，证明EIN2定位在ER上。

EIN2定位在内质网上【3】

我们在乙烯受体系列文章中介绍过，乙烯受体家族的5个成员，都在内质网有定位。那么，EIN2和受体之间有什么关系呢？ Groth组的科研人员通过FRET分析，证明乙烯受体ETR1和EIN2可以互作。随后又通过荧光滴定法（Fluorescence titration studies）进一步从体外证明了ETR1和EIN2的互作。

FRET分析证明ETR1和EIN2互作【3】

既然EIN2在乙烯的信号通路中起到关键性的作用，而它在mRNA水平上对乙烯又没有响应，那么它受什么调控，又是如何发挥作用的呢？
欲知后事如何，请听下回分解：《乙烯信号简史 | 成也EIN2，败也EIN2》。

【参考文献】
【1】Guzman, P., & Ecker, J. R. (1990). Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. The Plant Cell, 2(6), 513-523.
【2】Alonso, J. M., Hirayama, T., Roman, G., Nourizadeh, S., & Ecker, J. R. (1999). EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science, 284(5423), 2148-2152.
【3】Bisson, M. M., Bleckmann, A., Allekotte, S., & Groth, G. (2009). EIN2, the central regulator of ethylene signalling, is localized at the ER membrane where it interacts with the ethylene receptor ETR1. Biochemical Journal, 424(1), 1-6.

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