在上一讲的“三重反应”中，我们介绍了科研工作者们发现了不同植物黄化苗对乙烯处理发生不同的反应。其中，主要以拟南芥的“三重反应”和水稻的“双重反应”为代表。俗话说：“工欲善其事，必先利其器。”光知道植物对乙烯的反应还不够，关键是要开发出一套可行的工具或系统，为我们所用，来研究植物乙烯的信号转导通路。

一般来说，生物体的变异来源主要有两种：自然变异和人工诱变。在自然环境中，植物受到自身或外界因素的影响发生不定向的突变，这种突变可能导致植物性状发生改变，并稳定地遗传给后代，我们称之为自然变异。由于生物体具有非常有效的变异修复体系，因此自发突变的频率非常低，需要较长时间的积累才可得到丰富的变异，而人为进行化学诱变可以让植物的突变频率大大升高，在短时间内创造出大量的遗传变异。其中，EMS（Ethyl methanesulfonate）属于一种烷化试剂，可以导致嘌呤和嘧啶的转换，是目前公认的一种最为有效且应用比较多的化学诱变试剂。使用 EMS 诱变的方法创造新的变异，是研究植物基因功能的一种非常有效的工具，已经在拟南芥、水稻、玉米、小麦等多种植物中广泛应用。 

1. 利用“三重反应”筛选拟南芥乙烯反应突变体

1988年ANTHONY B. BLEECKER等在Science上发表了一篇题为“Insensitivity to Ethylene Conferred by a Dominant Mutation in Arabidopsis thaliana”的文章，首次报道了利用人工诱变和”三重反应“筛选拟南芥乙烯反应突变体。该文章鉴定到了一个显性突变etr，可使拟南芥的各个组织和器官在各个生长发育时期，都表现出乙烯不敏感的表型，并进一步将突变定位在一号染色体的ap-1位点附近。这个突变基因就是后来大名鼎鼎的乙烯受体ETR1，这也是通过遗传学方法鉴定到的第一个植物激素受体。从此，乙烯信号通路组分的遗传学筛选就拉开了帷幕。

拟南芥乙烯反应突变体筛选体系（Merchante等，2017；Hao等，2017）

两年后，Plinio Guzman和Joseph R. Ecker在The Plant Cell上发表了一篇文章“Exploiting the Triple Response of Arabídopsís To ldentify Ethylene-Related Mutants”，系统地介绍了如何利用拟南芥的“三重反应”和EMS诱变进行乙烯反应突变体的筛选和鉴定。并利用该体系筛选到了3类乙烯反应突变体eto1( ethylene overproducer )，hls(hookless)，ein1(ethylene insensitive )和ein2。其中，eto1黄化苗表现出组成型的乙烯反应，由自身乙烯合成增加所致；hls1黄化苗的下胚轴和根对乙烯的反应正常，但是不能形成弯钩，并且乙烯的合成减少；ein1和ein2都对乙烯不敏感，乙烯的合成增加，并且ein1很可能是etr的等位突变，而ein2则定位在4号染色体上，是一个新的乙烯相关突变位点。

利用“三重反应”筛选到的拟南芥乙烯反应突变体（Guzman, P.和Ecker, J. R.，1990）

在The Plant Cell文章中，Ecker指出了以拟南芥为模式研究植物乙烯反应的三大优势：1.三重反应非常明显，容易进行突变体的筛选；2.可以进行基因的定位和克隆；3.遗传转化系统也逐渐成熟。因此，Ecker呼吁大家以拟南芥黄化苗系统为模式，进行植物乙烯相关生理过程的研究。而 Ecker也使用该体系，鉴定到了一系列乙烯信号通路中的重要组分，并因此奠定了其在乙烯信号转导领域中“大神”的地位，还培养出了一批活跃在乙烯信号领域最前沿的的大牛，比如郭红卫老师和乔红老师。

2. 利用“双重反应”筛选水稻乙烯反应突变体

从上世纪八十年代开始，以拟南芥为代表的双子叶植物的乙烯信号转导通路研究进行的如火如荼，经过二十多年的发展，取得了丰硕的成果。迄今为止，乙烯的信号转导通路已经是研究的最透彻的植物激素通路之一。然而，单子叶植物乙烯信号转导通路方面的研究一直没有突破性的进展，归根到底是由于一直没有建立一套高效且稳定的乙烯反应表型鉴定体系。直到2013年，中科院遗传发育所张劲松课题组的马彪老师经过无数次的尝试和失败，最终摸索出了一套稳定的水稻乙烯反应鉴定系统，并利用该系统筛选出了一系列水稻乙烯反应突变体，相关成果以Identification of Rice Ethylene-Response Mutants and Characterization of MHZ7/OsEIN2 in Distinct Ethylene Response and Yield Trait Regulation为题发表在Molecular Plant上。

水稻乙烯反应突变体筛选体系（Ma 和Zhang，2017）

说起水稻乙烯反应突变体筛选体系的建立，还有一则趣事咧。话说当年马彪老师筛选水稻乙烯突变体时，起初是把水加到筛子面的，经过了许多次的尝试，一直也没有筛选到表型非常好的突变体。当时组里的许多人都劝马老师放弃，重新选择其他课题。可是，马老师从来不是一个轻言放弃的人，仍然不忘初心，对系统一点一点进行改进。直到有一次，无意中把水加少了，却意外地看到了非常明显的乙烯反应表型，并在此基础上逐步改进，形成了今天非常成熟的体系。俗话说：“万事开头难”。科学研究的过程并不是一帆风顺的，尤其是开始阶段更加艰难，这就需要我们有坚韧不拔的毅力和忍耐力，遇到困难和挫折时，不要轻言放弃，也许再坚持一点点，通往真理的大门就从此敞开了。马老师的经历就是最好的例证。试想，如果没有马老师当年的坚持，水稻乙烯信号领域的研究可能要滞后数年甚至数十年也说不准。在此，向马老师的“死磕精神”致敬!

3. 乙烯反应突变体筛选和功能研究的主要步骤

时至今日，拟南芥和水稻乙烯反应突变体的筛选和功能研究体系已经非常成熟，此处对一般的研究思路做一个大概的总结。

1. 对萌发的种子进行EMS诱变，收到M1种子后，自交得到M2后代。

2. 对M2植株进行乙烯反应表型的筛选，一般分为乙烯不敏感、钝感和过敏感。

3. 对筛选到的突变体按表型分类，对具有相同或相似表型的突变体进行等位分析。

4. 将突变体和野生型亲本回交，F1进行显隐性鉴定，并对自交得到的F2进行分离比统计，以确定突变表型是由单基因还是多基因控制。

5. 将突变体和乙烯信号通路中已知组分的遗传材料杂交，进行遗传分析，确定突变基因在信号通路中的位置。

6. 通过图位克隆或者BSA寻找候选基因，并通过遗传转化确定突变基因。

7. 确定突变基因后，对基因的功能，及其分子机制进行具体的研究。比如，如果突变基因是转录因子，就找它的靶基因，如果是酶就找它的底物，等等。从该步开始，就要具体问题具体分析了。

【参考文献】

Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., & Kende, H. (1988). Insensitivity to ethylene conferred by a dominant mutation in Arabidopsis thaliana. Science, 241(4869), 1086-1089.

Guzman, P., & Ecker, J. R. (1990). Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. The Plant Cell, 2(6), 513-523.
Hao, D., Sun, X.,Ma, B.,Zhang, J.& Guo, H.(2017). Ethylene.Hormone Metabolism and Signaling in Plants. Academic Press.203-241.
Ma, B., He, S. J., Duan, K. X., Yin, C. C., Chen, H., Yang, C., ... & Zhang, W. K. (2013). Identification of rice ethylene-response mutants and characterization of MHZ7/OsEIN2 in distinct ethylene response and yield trait regulation. Molecular plant, 6(6), 1830-1848.
Ma, B., & Zhang, J. S. (2017). Analysis of Growth and Molecular Responses to Ethylene in Etiolated Rice Seedlings. Ethylene Signaling: Methods and Protocols, 237-243.
Merchante, C., & Stepanova, A. N. (2017). The Triple Response Assay and Its Use to Characterize Ethylene Mutants in Arabidopsis. Ethylene Signaling: Methods and Protocols, 163-209.

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