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物理图谱（physical map）
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物理图谱(physical map)是在DNA分子水平上描述染色体中界标间顺序和距离的图谱。由于到目前为止末能发明直接对基因组DN A整体水平进行分析检测的技术，所以，只由于到目前为止末能发明直接对基因组DNA整体水平进行分析检测的技术，所以，只有将基因组DNA切割成小片段后插入不同的生物载体再转染到一些生物体中使其稳定复制，分析其基因片段拷贝，对克隆群插入DNA片段按其在原始基因组上线性顺序进行排序，构建物理图谱。物理图谱的终极图谱是DNA序列图谱。 物理图谱的终极图谱是DNA序列图谱即基因组序列图谱。
目前，分辨率最高的物理图谱是在序列专一位点(seguence-tagged site,STS)作为标记的基础 上，将插入人类DNA片段的克隆群按原来在染色体基因组上的线性顺序构建的图谱。STS可作 为整合遗传图谱和物理图谱的“公用图谱语言”，对采用不同作图技术构建的图谱进行比较 并对其进行整合，最终实现大规模基因组DNA测序将基因组DNA片段克隆进各种载体组建重叠克隆群是物理作图的基本策略，克隆载体在物理图谱构建过程中发挥着不可替代的作用。凡来源于质粒、噬菌体、细菌等可插入或克隆DNA片段的DNA分子统称为载体。载体的功能是为外源DNA进入受体细胞提供运载工具。经过载体重组的外源DNA比其单独进入受体细胞的效 率提高几个数量级。另外，载体可将外源DNA转移至受体细胞并在受体细胞内准确复制、大量扩增和明确表达。载体除具备上述功能外，必须具有从一个宿主细胞转移至另一个宿主细 胞的可移动性。上述克隆库的优点是能随机覆盖基因组很多倍，并在扩增过程中表现出不易缺失和不易重排的稳定性。?
第一节 构建物理图谱的重要工具---克隆载体?
一、 粘粒克隆?
1、粘粒(cosmid)又称柯斯质粒，是Collins J 和Hohn B 等于1978年为克隆真核DNA 大区段构建的带有粘性末端的cos位点质粒。即含有粘性位点的质粒重组体。cosmid来源于噬菌体和质粒DNA的整合，所能克隆的最大外源片段的DNA为45.9Kb。
2、YAC克隆?
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC) 是目前携带最大外源DNA片段的载体克 隆(100—200kb)。
1）YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DNA，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体(见图4-2)。?
2）YAC的主要用途是：(1)YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。它不仅可容纳大片段的外源D NA ，而且在构建基因组文库时需要较少的克隆。(2)用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。目前，用YAC提供大片段DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等动物中得到广泛应用，相比于早期的DN A片段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体。(3)在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用了YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥。?
3、BAC克隆?
在人类基因组分析中，普遍采用YAC克隆库作为组建含有大片段DNA的重叠克隆群，BAC只是一种补充的方法。但这种补充在克隆效率、重叠群排序、载体克隆的稳定性 和克隆嵌合体等方面要优于YAC。?
（1）BAC克隆载体的结构
BAC是F因子与大肠杆菌构建的DNA单拷贝重组体。1992年，Shizuya H等提出的pBAC 10 8L克隆载体系统主要包括：oriS、repE、parB、parA调节基因，当parA和parB使大肠杆菌 含有1～2个拷贝时，oriS和repE间接调节F因子复制；CM?R为抗氯霉素标记基因；克隆片段包括隿osN和P?1loxP切点； cosN位点提供了带有胧删?迥┒嗣傅淖ㄒ磺懈钗坏悖琇oxP与cosN均可作为限制酶谱的克隆排序末端；HindⅢ和Bam HⅠ为克隆位点；富含G+C 的限制性酶切位点有XmaⅠ、SmaⅠ、NotⅠ、EagⅠ、BalⅠ和SfiⅠ；T?7和Sp6为克隆切点的侧翼启动子，可作为染色体步查和插入片段测序的RNA探针。?
（2）构建BAC克隆库的过程包括：
a.外源DNA(包括HindⅢ和Bam HI切点、位点两侧T?7和Sp?6 序列及6个限制酶稀有切点)插入pMBO??131?的Sal I位点；b.含有cosN位点的400bp的Sa lI插入质粒SacI；c.在cosN和克隆片段之间的SacI位点插入P?1loxP,构成pBAC 108L质粒 。(见图4-3)
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（3）利用BAC克隆构建的文库有如下特点：a.组建BAC克隆的质粒可通过电泳转染到大肠杆菌内 ，转化效率比酵母原生质的转化效率高10-100倍。因此，BAC克隆库适于创建DNA资源受限制的特异性文库；b.虽然BAC克隆的DNA只存在于单拷贝pBAC质粒内，但适于传统的菌落培养 和杂交的BAC克隆DNA文库的筛选；c. BAC克隆含有插入DNA片段的F因子，它以超螺旋化状态存在于大肠杆菌质粒内，较易完整分离带有较少切点的大区段DNA；而YACs克隆以线性状态 存在，对剪切较敏感，不易分离为完整的大DNA片段；d.少量的DNA样品容易通过相同的电泳过程再渡转入细菌细胞；e. BAC F因子中的一系列基因能使外源DNA保留在BAC系统内； f.BAC?S中低频率出现的共克隆(co-cloning)在bottom-up构图方法(小于2Mb克隆DNA重叠克隆群相对于长片段限制酶切位点的图谱)中有显著优点。
第二节、物理图谱的构建方法
一、低分辨率的物理图谱?
1、染色体图谱或细胞遗传图谱?
细胞染色体图谱是最早、最经典的物理图谱。染色体图谱中的路标是在各种染料染色显带之后的染色体带型。这些带型通常把染色体分为10-20个区域，这是所有物理图谱的基础。?
原位杂交法是很长一段时间内进行基因定位的有效方法，也是低分辨率物理图谱的主要绘制方法。与构建遗传图谱不同的是，用原位杂交技术构建的物理图谱是估计每条染色体DNA大分子上的路标的物理学实际距离，即对碱基数目进行估计；而构建遗传图谱时，是将在整个生物中测到的性状利用重组常数确定各种遗传标记和基因间的统计学距离。?
原位杂交技术的分辨率较低，仅能达到几个Mb，改进的荧光原位杂交(FISH)技术也只是2～5 Mb的精度范围。在细胞分裂期间，染色体盘曲松散时，可使分辨率提高到0.1Mb。??
2、cDNA图谱?
概念：cDNA图谱也是一种细胞学图谱，但构成图谱的界标是cDNA或EST，即表达序列定位的细胞学图。
基因组中的许多表达序列区域可转录mRNA，以mRNA为模板经反转录合成钩状的DNA即互补DNA (complement DNA,cDNA)，用cDNA来标记特定染色体区域或区带上DNA表达的区域和位置。
特点：与基因组DNA克隆不同的是，用作反转录的mRNA模板是已经剪切的成熟RNA，间隔的内含子序列已被删除，所得到的表达产物cDN A克隆不含非表达序列，这样有利于集中对表达基因的定位和克隆，而且杂交中出现的假阳性( 虽杂交显示出荧光亮点，但为非表达序列)的概率也较低。目前，在构建物理图谱时，人们往往十分关注cDNA的小区域或EST序列，并利用这些特异性序列EST构建一套存在于表达区域内的STS系统，使EST或cDNA的大量拷贝通过合成、克隆、建库及测序成为STS随机筛选的来源。?
构建方法：cDNA作图的基础是构建cDNA文库(library)。以cDNA为探针，从基因组DNA克隆片段上寻找编码蛋白质区域，分离出相应的特异性基因。因cDNA与mRNA严格互补，cDNA直接反映了基因 中编码区域的相关序列，并确定其转译的氨基酸的排序。所以，?cDNA图谱可作为表达序列尤其是致病基因表达区域的识别工具。
目前，通过cDNA克隆与基因组DNA比较已确定了珠蛋白、生长激素、胰岛素等基因的结构。
人类基因组中的表达序列(即基因)仅占总序列的3%-5%，cDNA图谱不但可以提供一些末知功能的表达区域在染色体上的位置，而且能为候选基因克隆提供参考依据，更重要的是，若对 cDNA序列进行测定可直接发现重要的基因。
3、家系分离分析法(pedigree segregate analysis)构建的遗传图谱?
在遗传图谱的构建中曾提到家系分析法以及RFLP、MS、SNP等各种多态性标记构图法。将低分辨率物理图谱与遗传图谱进行对比，整合的遗传图谱提供的多态性标记的距离和位置可粗 略地对应于物理图谱的平均距离，即1cM连锁图距对应于1Mb的物理距离。?
目前，多态性STS最新遗传图谱的分辨率已达到1cM以下，相当于物理图谱的1Mb,因此，多态性STS可作为遗传图谱和物理图谱公用的标界把这两种图谱的不同距离统一在线性位点上。 ?
STS在不同个体中具有多态性，多态性STS主要包括因重复拷贝n的次数不同导致片段长度的差异。扩增出的STS可作为多态性DNA标记，确定与其他多态性DNA标记之间的距离， 并通过家系共分离分析进行遗传图谱的标记定位。在含有短序列(GT)n及两侧特异性的STS序列中， STS扩增产物长度取决于n的数目，是多态性的。每个个体携带一对姐妹染色体，有两个STS 拷 贝，两个STS拷贝可因n次重复而不同，即形成杂合态的等位片段。这样，多种杂合等位片段在连锁分析中含较高的信息度，在物理图谱中称为多态性STS， 这些STS很容易定位在物理图谱上，与遗传图谱结合可构建染色体图谱。所以，多态性STS可 在遗传图谱和低分辨率物理图谱的整合中架起沟通桥梁。
二、辐射杂交图谱(radiation hybridization map ,RH)
1、概念：辐射杂交图谱是利用体细胞杂交技术构建人类基因组高分辨率、大尺度范围的连续物理图谱的 常用方法。该方法以Goss和Harris(1975)等人的研究为基础，将体细胞杂交技术与PCR方法 相结合，利用统计学手段计算染色体位点断裂分离频率，推出位标之间的距离和在染色体上的排列顺序。其精度范围约为0.3～30Mb。?
2、构图方法：辐射杂交是利用含有全套鼠染色体和含有某条人类染色体的中国仓鼠体细胞进行杂交。含选择性标记单一染色体的体细胞作为供体，利用高剂量的X射线将候选染色体打断成若干片段，这种染色体结构被破坏的细胞与仓鼠细胞形成杂交克隆。依据染色体上位标相距越近其断裂频率越低的原理，通过Southern杂交和PCR方法研究杂种克隆中人基因组DNA 位标的分布，用类似于遗传重组原理和最大似然性法(maximum likelihood)来计算DNA片段 上多态性和非多态性STS之间断裂频率，断裂频率越高，STS间的距离越远，以此估计STS的实际距离。根据不同要求，构建断裂程度不同的多套拷贝，建立含有人类DNA片段的YA C克隆库，得到分辨率不同的辐射杂交图谱。
3、辐射杂交图谱的特点 辐射杂交图谱被认为是介于遗传连锁图谱和物理图谱的中间图谱，具有如下特点：?
①RH可以使用非多态标记。因为此法只分析人的单一相关染色体，不像减数分裂作图那样，只有多态性DNA标记才能区别一条染色体上的两个拷贝。这使得多态性标记和非多态性标记可通过辐射杂种图谱得到整合。?
②RH法与脉冲电场凝胶电泳法(pulsed-field gel electrophoretic,PFGE)联合使用使两方 法具有互补性。有些区域的DNA标记序列可用PFGE法确定，但此法不能建立标记间的次序和 距离。相反，RH图谱可构建连续图谱，但不能分辨PFGE确定的标记次序。若将两者适当结合，有利于多位点标记确定，构建高分辨率的物理图谱。?
③用RH法在细胞分裂间期绘制染色体区域图比用细胞遗传学法在细胞分裂中期绘制的染色体区域图更准确。细胞遗传分析法比RH法测得基因间的距离要高出30倍左右。原因是RH法 是在细胞分裂间期产生的染色体断裂的基础上构建的，这一时期的染色体高度解旋；而细胞遗传分析法是在细胞分裂中期进行，染色体高度浓缩。由于染色体交换发生在解旋期，所以 用RH法计算的子代重组频率所构建的图谱更为精确。?
④由于一些不易建立重叠群的基因组区域(如某些G-C)富集区较难构建物理图谱，可采用RH 图谱加以补充。因此，精细的RH图对基因组作图的完整性是十分必要的。?
三、高分辨率的物理图谱?
1、 限制性酶切位点DNA指纹法?
限制性酶切位点DNA指纹法是指用稀有酶切位点的限制性内切酶切割单条染色体，以重复序列中的“核心序列”为探针进行Southern印迹杂交，形成多个限制酶切杂交带，绘出捕获相关序列(基因)的限制性内切酶图谱。这种不同克隆片段的DNA特征就如同给出的DNA指纹，故 此法又称DNA指纹法。
1985年，Jeffery等首次利用串联的短重复序列形成的RFLP作为不同个体的特征标记。其基本过程是：用稀有酶切位点的Hinf酶(此酶在重复序列中不存在切点)剪切基因组DNA，形成 长短不等的DNA片段，电泳后形成不同距离的电泳带，用32P标记的核心序列做杂交探针，放射性自显影显带，根据杂交带的特异性进行个体鉴定。在此基础上，将RFLP与PCR联合应用，使检测效率大大提高。用PCR扩增待测基因和探针片段，以适宜的限制性内切酶消化PCR产物，再将消化后的PCR产物变成单链，用凝胶电泳分离单链DNA，这样，基因突变的单链DNA可通过在同一块胶膜的单链DNA电泳迁移率上反映出来。目前，限制性酶切位点DN A指纹法已应用于法医学检测和亲子鉴定等方面的研究。?
2、 重叠群图谱?
重叠群(contig)或重叠克隆群 (overlapping sets of cloning)是一组带有外源DNA的载体 叠连群。这组克隆了外源DNA片段的载体可通过末端重叠序列相互连接成连续的DNA片段，确定出重叠DNA片段克隆的顺序和距离。这种根据重叠群末端序列互补，通过克隆载体把外源D NA片段按染色体上位置排列出来的图谱称为重叠群图谱。重叠群图谱是目前最为经典的高分辨率物理图谱，在DNA测序中有重要用途。?
a.YAC克隆库构建重叠群图谱?
b.BAC克隆构建重叠群图谱?
第三节 完整物理图谱的构建策略
一、构建完整物理图谱的基本要素?
(1)界标(marker)
界标是绘制图谱的标记工具。构图方法不同，界标的种类、界标间的 距离、图谱的分辨率也不同。图谱中的界标包括采用家系分析法构建的遗传图谱中的基 因，DNA原位杂交法构建的遗传图谱中的DNA探针，用RFLP、MS、SNP等作为标记构建遗传图谱中的DNA多态性。低分辨率的物理图谱界标有STS和cDNA(EST) 。高分辨 率的 物理图谱界标：一是基于STS构图法STSs界标；二是限制性酶切指纹法构图中的限制性酶切位点界标
(2)作图单位
根据构图方法确定。限制性内切酶的酶切片段是物理图谱的基本单位。以STS 为路标构建图谱是以STS作为基本单位；以碱基构成的终极物理图谱则以碱基对为基本单位。?
(3)确定标记顺序
确定标记位点相互之间的衔接关系是制作图谱的主要目的。将全基因组 的 不同界标单位进行排序的方法包括：限制性酶切指纹排序、重叠连续克隆序列(STC)排序、计算机软件排序、染色体步查和跳查填补间隙排序等。目前，新型技术全基组散弹法或鸟枪 法(shot-gun)可随机对DNA进行大规模测序，即绕过BAC克隆逐个排序过程，直接将基因组DN A分解成2Kb左右的小片段进行随机测序，辅之一定数量的10Kb克隆和BAC克隆末端测序(500b p)，利用超级计算机进行序列组装。?
(4)具有DNA可复制系统
除可见图谱外，其他图谱的构建均需DNA复制系统。包括YAC、BAC 、粘粒、福斯粘粒、M13?和P1等载体系统。上述复制系统在组装DNA片段的容量、插入外源DNA后的稳定性、克隆嵌合体以及构建基因文库所需的克隆数量上均不相同?。
二、完整图谱构建的步骤?
1、分离大片段DNA分子?
从染色体显带的低分辨率细胞学作图到限制酶切指纹、重叠克隆群的高分辨率物理图谱，分离到的DNA片段的大小差异很大，可介于10Mb到100Kb之间。方法是：利用不同的限制性内 切酶将DNA切成长 度不等的片段，通过琼脂糖凝胶电泳法和脉冲电场凝胶法将大到10Mb的DNA片段进行分离 。分离后的DNA片段经直接染色使DNA显带，或通过DNA分子杂交，使标记放射性同位素或非放射性同位素标记的探针能在数以百万计的不同DNA片段溶液中找 到与其互补的DNA链。虽然这些方法能分离DNA片段，并确定与其相应的探针的顺序，但不能使分离的DNA片段按染色体上的顺序进行排序。?
2、大片段DNA和DNA克隆库排序?
把覆盖一条染色体的50—500个大DNA片段进行排序以构建低分辨率图谱的排序方法有两种：一是用两种不同的限制性内切酶分别切割基因组DNA，可以产生两套彼此重叠的DNA片段，再 用适当的探针将相邻的重叠片段鉴定出来。二是只用一种限制性内切酶产生大片段，再用一套连点探针(linking probe)与两个不同的大DNA片段杂交，由于探针是由酶切大片段产生的 小片段制成，含有特定酶切位点顺序，所以可确定大段DNA在基因组中的邻近关系。?
然而，高分辨率的物理图谱必须采用克隆排序。染色体上DNA片段的克隆是随机的，库中的每个克隆通常都与相邻的数个克隆有广泛的重叠，克隆库的高度重复使染色体的任一片段将 出现在数个不同的克隆库中。目前，利用克隆库进行高分辨率物理图谱的排序有五种途径：?
① YAC是装载DNA片段最大的克隆库，插入外源DNA片段是细菌宿主系统中(BAC)克隆片段的10 倍：
② BAC是一种可取代YAC的新方法，克隆效率高，克隆载体的稳定性好，克隆嵌合体极少；?
③ Cosmid作为亚克隆的载体克隆系统，在重叠群连接时起重要作用。代表基因组转录区的 cDNA克隆库可作为另一类确定DNA大片段间衔接关系的探针(cDNA探针)，检测不含内含子的 编码区在基因组中的衔接次序；
④另一类利用经过标准化的家族连锁分析进行排序的FRLP探针套，可将大片段DNA克隆进行排序。?
⑤现有许多指纹法可用来鉴定重叠克隆并排定克隆库次序。
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