表观遗传学的一段多彩历史

李福洋

现今的表观遗传学搞得如火如荼。今天要侃的，其实是表观遗传学漫漫历史长河中一条支流所泛起的几朵浪花，这条支流就是DNA甲基化和去甲基化。

DNA甲基化是较早发现和得到认可的一种表观遗传学修饰，就是在碱基胞嘧啶（cytidine, C）的嘧啶环上第5位碳原子加上一个甲基基团（-CH3）。这种修饰并非发生在DNA序列所有的C上，而主要是在CG一起出现是的C上（后来发现：在胚胎干细胞，也有很多甲基化发生其他C上）。别小看了这一个小小的修饰，却给DNA增加了额外的信息，使得有限的基因组遗传信息的表现呈现出丰富的多样性和可塑性。

你可能会问了：这额外的信息究竟是些什么呀？这可能几句话说不太清，这样吧，我们先简单地把DNA甲基化理解为“一把锁”，凡是被DNA甲基化标记的部分，大都是需要被“尘封”“监禁”的基因，比如基因组的“捣蛋鬼”—转座子，就是被甲基化这把“锁”管制着，失去管制或管制不严，这些“捣蛋鬼”会在基因组里跳来跳去，把基因组搞得一团糟，会引起很多问题，如肿瘤、精神疾病（自闭症等）等，这个话题我以后会专门聊。

DNA甲基化最符合表观遗传的定义了。DNA甲基化在体细胞水平是十分稳定、且可遗传的，也就是说，体细胞分裂形成的“女儿”细胞（还可以继续分裂）不仅继承了“母亲”细胞的基因组DNA序列，还十分忠实地拷贝了“母亲”细胞基因组DNA的甲基化模式。但是，在生殖细胞形成过程中，还有受精卵向胚胎分化的过程中，基因组DNA的甲基化要经过一个大规模的“重塑”，而且时间窗口很短。例如，受精卵在分裂前，显然对精子的基因组ＤＮＡ甲基化进行了一次“清洗”，在受精卵分裂后很快又开始快速重建。另外，还有生殖细胞（精子和卵子）的形成过程中，也有这么一个甲基化重塑现象。这就提出了一个重要的基本问题：DNA甲基化在这么短的时间内事如何被“清洗”掉的？回答这个问题的关键就是找到能够将DNA的甲基化基团去掉的DNA去甲基化酶（DNA　demethylase）。

然而，这个问题提出容易，解决起来却很不那么容易。从提出来伊始，花了很多人十几年的功夫，却一直悬而未决！为什么？DNA去甲基化这个过程只限于卵子受精后分裂前和生殖细胞生成过程，时间窗口很短，细胞来源有限，无法获得足够数量的细胞或组织进行分子生物学操作来鉴定基因，更无法进行生化操作去纯化酶，因此研究起来极其困难。多年以来这DNA去甲基化过程一直是一个很大的谜团。

问题很重要，可是“狗咬刺猬-无从下口”。

中间有段插曲。有个加拿大的犹太裔生物学家Szyf教授made a big joke。Szyf教授也算是DNA甲基化领域的一个元老了，然而这老先生他剑走偏锋，最后成为这个领域的另类科学家，边缘人物。他的实验室报道发现了一个DNA去甲基化酶出来，发在1999年的Nature上【1】，一时间在圈内引起轰动，但是其它实验室重复不出来，这就很严重了， Szyf在JBC上还专门给出详细条件，给大家分析为什么难重复的原因，但后来还是没有人报道说重复出来的。这老兄倒还是坚持不懈，不停地给ＪＢＣ灌水，用不同的系统证实去甲基化酶的存在。那时俺入行不久，也从这些JBC文章中看出些破绽来了，还想花点时间做点东西批驳他们。于是就跟老板谈起Szyf和他的工作，老板一脸的不屑，并说那是浪费时间。对待垃圾，科学家没有时间去证实它是垃圾，只有掩面而过（这是我的理解）。我当时还有一个疑惑，JBC怎么还能容许他灌水呢？朋友老徐说，学术界大概还想保留这种异端的声音和探索，没准哪天还证明Szyf是对的呢。有段时间大家都挺忌讳提DNA去甲基化酶这个概念，怕被别人耻笑吧。

　ＤＮＡ去甲基化的研究从此沉寂了若干年。

但是，还是有些有远见的科学家一直还在思考这个问题，并没有停止探索的脚步。（不好意思，俺也为这个问题着过一段时间的迷，可惜找不到解决的办法，一些想法被某大牛否定，另外，俺自己也确实没有这个金刚钻，最后也就放弃了）。

2005年，施扬的实验室发现组蛋白去甲基化酶和催化机制，引起轰动，这也鼓舞了人们去寻找和鉴定DNA去甲基化酶的信心。北大尚永丰实验室报道了在卵巢癌细胞有基因特异性“主动DNA去甲基化”的现象，美国朱健康实验室在植物发现并鉴定了ＤＮＡ去甲基化酶。然而，哺乳动物的DNA甲基化酶，依然是“犹抱琵琶半遮面”，“千呼万唤不出来”。

2008年又有德国多家实验室联合，和法国实验室在Nature上发表两篇论文，报道了载体细胞内局部性的主动DNA去甲基化过程【2，3】。这时，ＤＮＡ甲基化领域的一个亚牛-哥伦比亚大学Bestor出来在Cell上带有讥讽的口吻评论这件事(The colorful history of active DNA demethylation.我这篇博文也从他这借个副标题)【4】。稍早些时候，海德堡的发育生物学家Niehrs在Nature上发文报道一个DNA损伤诱导蛋白Gadd45a促进DNA去甲基化【5】，但是当即引来针锋相对的反驳。美国加州贝克曼研究所的Pfeifer 实验室在PLoS Genet.上发文否定Niehrs的结果，题目也针锋相对，火药味十足：

GADD45A does not promote DNA demethylation【6】!

但是，后来相继有几篇来自不同实验室的报道肯定了Niehrs的结果。尽管如此，还是有些问题：１．Gadd4a基因敲除病并不妨碍胚胎发育，也不会影响受精卵分裂前的去甲基化过程，2. GADD4a 其实并不是真正的去甲基化酶，它只是启动一种DNA修复机制，叫核酸切除修复（Nuclear acid excision repair, 简称NER，主要用来修复紫外线对DNA的损伤），把一段甲基化的DNA切了，重新合成新链。这个机制在局部或者是个别基因特异性去甲基化中发挥作用是可以理解的，作为普遍的机制，参与全基因组甲基化的重新编程，恐怕让人接受不了。打个比方，如果想把墙体颜色换了，你是愿意把墙上的砖拆下来换成新砖呢，还是只是把把砖上的涂料／漆除掉呢？尤其是对整栋楼的大面积换的时候？，毕竟一方面是效率问题，另一方面是经济问题。

终于迎来2009-2010，这时，DNA去甲基化酶才“千呼万唤始出来”，正式走上舞台中央，成为耀眼的新星。

第二部分：多彩历史 之 峰回路转

DNA去甲基化酶的发现和鉴定颇能代表两种不同的研究模式。

（两种研究模式，两个半机制，7个分子。）

研究模式1：假说驱动型研究（Hypothesis driven）

这是经典的科学研究模式，需要首先提出假说，然后设计实验验证之。假说很多时候都是错的，因此对我们一般人而言也是高风险的一种策略。这种策略的成功不仅需要直觉、想象力和勇气，还需要丰富的经验和扎实的基础，当然逻辑推理能力也是必不可少的。欣赏高水平的科学研究，有时会有读福尔摩斯探案般的智力享受。在DNA去甲基化的研究上，我们可以欣赏两个hypothesis driven 的典范。

首先出场的，是Anjana Rao，原哈佛大学病理系免疫学家，现在到了加州拉霍亚变态反应研究所，２００８被选为科学院院士。她原本不是表观遗传学圈内人，但是大牛就是大牛，一出手就是大手笔，就像当年施扬，原来也不是专门做组蛋白甲基化修饰的，但是灵感来了，闯入表观遗传学领地，还是做出了出人意料的重要发现。

Rao的想法是，DNA去甲基化可能是通过氧合（羟化或加单氧反应）的机制，这种想法可能是从一种模式生物-非洲锥虫（非洲锥虫病，导致嗜睡）的研究中获得的启示。锥虫中有一种酶JBP1，它可以把胸腺嘧啶的甲基加一个氧（羟化），形成羟基，然后由其它没酶在这个羟基上连上一个糖基，这样形成一种独特的结构(被命名为J结构)，虽然没有除去原来的甲基基团，但在基因的表达调节中发挥作用。胸腺嘧啶和甲基胞嘧啶的结构十分类似（都是嘧啶环），甲基基团的位置相同，Rao推测在高等生物可能也存在类似的酶和机制。基于这个假设，他们通过蛋白序列进行多轮同源搜索（PSI－blast），终于在人和鼠的蛋白数据库找到了三个基因Tet1, 2, 3. 而且发现这类基因在后生动物门中都普遍存在,提示这种功能机制的重要性和保守型。

通过细胞学实验和生化分析，他们获得两项极其重要的发现：1.证实这三个蛋白都对甲基化胞嘧啶具有氧合修饰作用，只是活性强度不同，这应该是他们所期望的计划内的成果；2.甲基胞嘧啶被氧合反应催化之后形成了新的修饰形式-羟甲基胞嘧啶(Hydroxyl-methyl cytidine, hm-C)，这种修饰形式赋予DNA新的表观遗传学特性和信息【7】；这第二项发现可能是出乎意料的计划外成果，可能影响更为深远。

紧接着，他们又将工作快速推向深入，把这种修饰与造血细胞的分化联系到了一起(2009年Science)，然后还发现其异常（Tet2突变、缺失）与血液系统肿瘤发生密切相关（2010年Nature）【8】。表观遗传学领域的一个明星人物张毅(他在组蛋白甲基化和去甲基化领域工作在国际上都是做得最好的（之一），目前还风头正健。大家可能不知道，他PostDoc期间做的工作其实更多的是DNA甲基化），在这时候也快速介入，发现Tet1介导的羟甲基胞嘧啶修饰在维持干细胞的自我更新（renewal）功能上发挥重要功能（2010年Nature)【9】。

2011年，DNA羟甲基化修饰工作成为Nature的常客（Nature 18 Jul 2010；Nature 30 Mar 2011；Nature 03 Apr 2011；Nature，13 April 2011, Cell 14 April 2011）。

老伙计玩起新把戏（Old Dog, New Tricks）

这也是个典型的Hypothesis driven的研究结果。故事的主人公都是来自英国剑桥的M. A zim Surani和Wolf Reik，两位牛人。他们的理论模型是：甲基胞嘧啶通过脱氨作用形成的尿嘧啶，尿嘧啶只能在RNA出现，如果在DNA出现，或者被细胞认为是合成的过程中掺错原料了，或者被认为是碱基化学损伤，总之，细胞会触发碱基切除反应（base excision repair, BER），这和那个NER有类似的地方。这时，一个90年代初被发现在免疫系统能够发育中发挥重要作用的分子AID（碱基胞嘧啶脱氨酶）进入了探索DNA去甲基化酶者的视野。

AID在过去的20多年一直是个明星分子，最初是由日本著名的免疫学家本庶（Honjo T）的实验室克隆出来的AID的克隆和功能阐明，对B细胞发育和抗体多样性的形成大大地向前推进。这样一个老分子，却被发现有了新的重要功能。M. A zim Surani和Wolf Reik这次用的系统是原始生殖细胞。前面提到过，生殖细胞形成过程中也有一个主动去甲基化过程，配子全基因组DNA被“清洗”、重建。在AID基因敲除细胞，这两个实验室都发现精子的去甲基化受到显著影响，但仍还有部分发生，说明还有其它机制的存在。最后他们都证实AID参与的去甲基化是通过对甲基化胞嘧啶的脱氨作用启动碱基切除修复完成的【10，11】。就像把整个大楼许多部位的某些抽出来，换上新的，虽不够经济节约，但是确实发生了，我们只能相信事实，而不是经验和常识。

研究模式2：系统筛选型

如果没有线索，没有头绪，没有想法（假说）怎么办？撒大网，捞，系统地捞。

饶海的一篇精彩科普博文（当蒋科学遇上李鬼）中提到的史蒂芬．鳄乐基(Stephen J. Elledge)就是靠建立功能强大的RNAi筛选系统这张超大超强的“网”发家的。 他建立这个超级捕捞系统就像是一个超大的捕鱼船，配备超大的网（把所有基因一网打尽）、自动化操作（barcode系统+基因芯片），那可成了功能基因组研究中新的海上霸王。

要进行筛选，必须要有一个可靠又有适合筛选的观察指标（indicator），就像钓鱼要有“浮漂”让你判断有没有鱼上钩。２００９年，北卡的张毅实验室设计了一个巧妙的实验，并用受精卵细胞进行筛选，并成功地打开了了一个小缺口。

（这部分需要些专业背景） 首先他们设计了一个能检测活细胞基因组DNA甲基化状态的方法。细胞内有一类蛋白能专门识别和结合甲基化DNA（methyl DNA　binding protein，MBD），如果把MBD与绿色荧光蛋白连起来（融合），相当于给MBD加上了一个荧光标签，可以在显微镜下直接观察和追踪MBD的位置。一般情况下， MBD-GFP是与基因组上甲基化的DNA结合，在在荧光显微镜下呈现绿色的斑点(foci)；在基因组甲基化被清除时，MBD-GFP就无处可以结合，因此就分散在细胞核内，在显微镜下，原来那些绿色荧光斑点消失，而变成了弥散的绿色。这样通过观察荧光信号的变化来判断基因组甲基化的变化。

有了这个判断指标，下面就可以筛选了。要通过RNA干扰技术，把选定的基因一个个分别”干掉“，然后通过观察荧光信号的变化。如果某一个基因被干扰之后，在受精卵细胞内的荧光斑点状信号不消失，或消失的十分缓慢，这就提示这个基因可能参与基因组的去甲基化过程。是不是这个基因在起作用。这项筛选工作量还是蛮大的，因为他们筛选了４０００个基因，那得需要4000-8000个受精卵，具体工作主要由一个中国女博士后做的。最后他们拿到了一个效果肯定的候选基因，原来是一个转录延长因子ELP3【12】。具体什么机理，还不清楚。

最近，Johns Hopkins大学医学院的华人科学家Song Hongjun在最新一期Cell上发表研究论文，将Tet1催化的羟甲基化反应和AID催化的脱氨反应统一了起来【13】。

DNA去甲基化这曾经的一块铁板，终于被撬开；果然，下面有很多金银财宝啊，你难道不想挤进去也抢一点么？

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