双孢蘑菇菌丝的草酸钙结晶过程和形态特征

1887年，Bary描述并阐明了四孢蘑菇菌丝的草酸钙结晶情况，Bary指出：这些沉淀使菌丝呈现“…一个垩白的外观”，从他对这些结晶的手绘结果，我们可以看出：长长的一根菌丝上面有类似于针尖状的结构，这些结构与培养料上生长的菌丝上发现的结晶物比较相似。

虽然说真菌细胞壁沉淀矿物质是比较常见的事情，但是，众多关于真菌结晶草酸钙的潜在作用还没有得到确切的答案：钙离子和草酸根离子是如何通过菌丝转移的？是什么促使在菌丝细胞壁上的结晶的发生？真菌结晶草酸钙在森林生态系统中的作用是什么？

双孢蘑菇是一种重要的商业栽培蘑菇，与四孢蘑菇比较接近，同样在菌丝上也发生着草酸钙结晶簇。Eger（1964）对双孢蘑菇氧分泌与担子形成做了研究，同时通过远红外光谱分析指出，双孢蘑菇菌丝上具有二水合草酸钙。Wood（1985）描绘了双孢蘑菇的各种超微结构，详细的提及了菌丝上的草酸钙结晶沉淀情况。

尽管目前有大量的关于双孢蘑菇菌丝结晶草酸钙的研究报道，但还没有关于草酸钙沉淀发育过程的有效研究。本文主要通过观察自然条件下或人工培养基上双孢蘑菇菌丝上草酸钙的形成过程，鉴定发生的草酸钙结晶晶种，并探讨这些结晶的可能功能。

图版：图1,2稻草上的双孢蘑菇菌丝。1，空气自然干燥后进行扫描电镜观察，显微观察显示，菌丝上呈现出大量的结晶物，像“奶瓶刷、试管刷”一样，标尺10um；2，对生长在谷物上的菌丝进行低温断裂显示，生长结晶的菌丝生长在谷物果皮（P）的外表面，注意生长在果皮内部的菌丝，标尺10um；图3,4 麦芽膏培养基上的双孢蘑菇菌丝扫描电镜照片。3，能谱显微分析，对菌丝上面结晶物进行线扫描，横线表明电子束的移动路径，竖点表明随着扫描线上的钙离子浓度含量变化，标尺，1um；4，气生菌丝上的草酸钙结晶物沉淀，菌丝上呈现大量的结晶物，结晶物与菌丝呈相切方向。箭头表明的可能是一个双晶体，标尺10um。

图版：图5-7， AC培养基上双孢蘑菇菌丝的扫描电镜照片 5，双孢蘑菇气生菌丝上生长的长结晶早期生长情况，注意（括号内）菌丝细胞壁中隐匿着小的结晶体，标尺1um；6，片状结晶的早期生长情况，标尺1um；7，片状结晶，注意，片状结晶的大小，角度和沉淀重叠情况，标尺1um。

结果：

在麦芽浸膏培养基上，双孢蘑菇菌丝在3周的时间内长了大约125px，菌落由丰富的基内菌丝和稀疏的气生菌丝组成，偶尔，有菌丝表现出缕状，气生菌丝在某种程度上呈现垩白色，用体式显微镜进行仔细的观察发现，菌丝上面具有纤细的，长的结晶物。当通过一个正交偏光显微镜进行观察时，其表现出弱的双折射现象。当菌丝在营养丰富培养基上生长时，气生菌丝表现出不同的两种区域，一层是结晶物丰富的菌丝层，通过菌丝连接到培养基表面，另外的就是琼脂表面的松散交织状无结晶菌丝物。谷物培养基上的菌丝结晶情况和琼脂培养基上结晶情况极为相似。

谷物培养基上的双孢蘑菇菌丝扫面电镜结果显示，结晶菌丝层覆盖在谷物的表面（图1），谷物内部的菌丝似乎不产生结晶（图2）。贴伏在谷物表面的菌丝通常也不产生结晶，这样的情况和ME琼脂培养基上类似。通过化学方法固定的谷物上的菌丝结晶比自然干燥的处理的样品上的结晶浓密程度要小，似乎是液体固定和脱水处理使一些长结晶脱落或损坏。

在ME琼脂培养基上，扫描电镜照片显示，菌丝表面具有长的、针尖状到扁平状的结晶物。每单位菌丝长度上的结晶数量变化不一，一些位置非常多，而其他一些区域又极其松散。在图4中，几乎有超过125个结晶物（结晶体）存在，长的结晶有超过10um长，0.2到0.5um宽。偶尔也有双晶存在。结晶在菌丝上的位置有一些变化，现行的结晶与菌丝的长轴走向相垂直，且相切与菌丝的表面。琼脂表面的菌丝通常缺少结晶，而气生菌丝通常具有丰富的结晶簇。X射线显微分析证实结晶沉淀物种有钙离子的存在。

AC培养基中菌丝上首先形成的结晶物和ME培养基上形成结晶物类似，都是有长的、尖状结晶组成（图5）。结晶形成的最早期（图5）显示，在菌丝细胞壁里面隐匿着一些结晶物，这一些幼嫩的结晶物相当的小，长度小于1um，宽度小于0.1um，随后，结晶在长度上开始变大，并在一定程度上相切与菌丝的表面。随着持续的增大，结晶物整个从菌丝表面分离出来。另外也有一些，长的、大的、片状的结晶形成于菌丝的表面（图6,7）。片状菌丝的早期阶段表明他们是由细长的形式逐渐变化而来。片状结晶非常薄，波浪状到周角状的边缘，并且经常堆叠在一起形成大的聚集体（图7）。

对于不染色的切片进行透射电子显微镜观察显示，草酸钙结晶沉淀为电子不透明区域，其紧贴在菌丝体上。ME培养基上生长的菌丝在细长的腔室中有电子不透明沉淀（图8a）。而在AC培养基上，经常包含部分电子不透明扇形腔室（图8b）。

超薄切片染色结果显示，AC培养基上生长的菌丝具有大的片状结晶腔室，沿着晶体的四周扩张（图9），在ME培养基上形成的晶体更加典型，典型的晶体同样也存在于AC培养基上。切片发现，这些晶体紧贴的或隐匿在菌丝的细胞壁上（图10）。晶体看起来开始于具有一个中心的电子致密的矩形区域斑块（图11），尽管大的片状结晶沉淀被一个单一的鞘环绕着，他们看起来是由单一的亚单位组成，（图12），菌丝的细胞壁通常情况是薄薄的，由结晶腔室层所包裹（图8a，9）。X射线能谱分析显示，ME培养基菌丝上形成的结晶为二水合草酸钙。

图版，图8，双孢蘑菇透射电镜不染色结果。8a，麦芽浸膏培养基，注意长的晶体腔室（c）相切与菌丝表面（h），腔室中间的电子不透明片状结晶沉淀，标尺1um；b，AC琼脂培养基上，结晶腔室中的电子不透明物质（c）是结晶残余物，注意腔室中的条状分割形式，h是菌丝，标尺1um。

图版双孢蘑菇结晶透射电镜染色照片，图9，一个气生菌丝和膨大结晶腔室（c）切片，有一个薄薄的鞘（箭头所指）覆盖在整个晶体腔室表面，标尺1um；图10，杆状结晶腔室，电子密集层表明菌丝周围环绕着结晶腔室，标尺1um；图11，结晶腔室和包被的鞘，标尺1um；图12，高放大倍数下面，可能的早期结晶体，菌丝细胞壁外层电子密集物质环绕的一个矩形空白区域，标尺0.1um。

讨论：

双孢蘑菇菌丝细胞壁上形成的结晶物和Arnott（1983）所描述的木腐担子真菌菌丝结晶物类似。双孢蘑菇菌丝上开始形成结晶以后，结晶物就开始向细胞壁外侧生长，逐渐形成一个类似的菌丝保护鞘。这样的菌丝鞘是否会扩大覆盖于整个菌丝还不太清楚。通过TEM对一些结构的研究发现有一些破裂的鞘，但不清楚这些破裂是自然状态下就是这样还是实验操作人为造成。

双孢蘑菇气生菌丝上结晶的基本形式是长长的棒状结构，环绕生长在菌丝的一周，这种结晶形式是ME培养基和谷物培养基上双孢蘑菇菌丝结晶的主要形式。一些结晶特别是那些纤细弯曲的结晶体通过扫描电子显微镜进行了详细的观察分析，对于弯曲的结晶体而言，似乎是由于电子束的轰击所致，而并非是正常的结晶形态。双孢蘑菇菌丝细胞壁中结晶腔室的精确起源还不太清楚，但这似乎与菌丝细胞壁外层的电子致密区域有一定的关系（图11），这些区域在结晶形成过程的准确角色仍需进一步研究。

在营养丰富的培养基上，菌丝上所形成的片状结晶可能是从基本的棒状结晶体生长而来。无论是棒状结晶体还是片状结晶体都是以环周形式存在于菌丝上，所以可能的结论是结晶的形成倾向于形成于菌丝的表面。当棒状结晶体继续生长，对大部分结晶而言是在在长度上伸长形成长棒状结晶体，而如果在长度和宽度上都持续生长的话就会形成片状结晶体。

草酸钙结晶将形成何种结晶体的机制不太明了，但这个过程可能如Cody（1984）所述。Cody认为，草酸钙的结晶体的变化行为可能是由于化学杂质阻止了特定晶面的生长定向生长，因此导致没有超大的晶体的形成。从这个理论可知，双孢蘑菇的片状结晶体可形成有边缘的面状体，这样的面状体的表面是“不纯净的”，以至于晶体在厚度上没有或很少有变化。

双孢蘑菇形成草酸钙结晶沉淀可能有几个功能，水玉霉目孢子囊上草酸钙结晶沉淀被认为是为其提供一个疏水层（Buller 1934），双孢蘑菇气生菌丝当然也是疏水结构，以至于我们气生菌丝进行做电子显微镜前处理的固定过程中湿润菌丝时遭遇到大的困难。自然状态下，这样的疏水现象可以保护气生菌丝免受水浸的伤害，保持一个干燥的气生菌丝状态同时可以免受细菌和其他真菌的侵袭。另外的可能的功能是，这样的结晶沉淀可以组织节肢动物的侵袭，如Thompson（1984）所述，气生菌丝表面形成草酸钙结晶沉淀，可以在一定程度上形成一个物理屏障，保护菌丝免受掠食。

虽然对于高等植物中形成的草酸钙沉淀的普遍解释是移除草酸根离子（Frey 1982），但仍有人普遍认为草酸钙的结晶是移除钙离子或钙离子的脱毒作用（Arnott 1982，Borchert 1985）。事实上，最近有科学家指出，生物矿化可能是生物体在古海洋环境下清除体内有毒的高浓度钙离子的一种进化机制，正常的细胞内钙离子浓度是比较低的（10^-8~10^-5M），钙离子的脱毒效应似乎是真菌形成草酸钙结晶沉淀的一种原因。

Whitney（1986）认为，接合真菌草酸钙结晶沉淀可能是一种钙离子脱毒效应，双孢蘑菇草酸钙结晶沉淀也可能是降低环境中的钙离子浓度。真菌降解外界物质时毫无疑问的需要在微环境中释放了大量的相关离子，进一步而言，既然很多真菌酶解外来物质，控制菌丝周围微环境的离子浓度似乎是有必要的，以确保酶的最大活性。通过从环境中转移钙离子到气生菌丝，进而将钙离子以草酸钙的形式整合起来，以至于钙离子的浓度以及其他潜在的毒害效应得以有效的降低。

点评，

1.      真菌草酸钙结晶不算是一个特殊的过程，很多物种都有草酸钙结晶现象，如双孢蘑菇，鬼伞，裂褶菌，木耳以及一些菌根真菌等，子囊菌，担子菌，接合菌都有。

2.      草酸钙不溶于水，在常规的制片显微观察可以很容易发现。不过也很容易被忽视。

3.      结晶体的形式也多种多样，有片状，长棒状，八面体型，四方体锥形等。菌丝上常见的是长棒状，片状和四方体锥形，子实体上似乎锥形占主要。

4.      除了菌丝结晶外，另一个常见的结晶区域是担子真菌的囊状体上结晶。对于囊状体上结晶功能推测，疏水作用可能是首当其冲。但情况并非这么简单，研究发现，没有菌丝的玻片上或菌丝周围的培养基上同样存在晶体，这似乎又是由于草酸离子和钙离子的外排凝集所致。

Whitney, K.D., H.J.Arnott. （1987）Calcium oxalate crystal morphology anddevelopment in Agaricus bisporus. Mycologia. 79(2):180-187