普通羊肚菌单孢分离物的培养研究

Annette Hervey（1978）Cultural Studies of Single Ascospore Isolates of Morchella esculenta

如普通羊肚菌（Morchella esculenta）一样，尽管羊肚菌的种类繁多，在自然环境可以形成子囊果，但在可控的实验条件下还没有成功的栽培报道。实验室的研究通常都是开始于菌柄部位组织分离得到的菌丝，结束于培育健壮的营养菌丝阶段。

羊肚菌营养菌丝的形态学、细胞生物学和营养特性是最为人们所熟知的。菌丝由隔膜隔开，每个细胞有多个细胞核。可以形成菌核结构，对于羊肚菌无性孢子的首次报道，也是唯一一次发生在1904年，Molliard的研究报道，迄今别无他人，也无法证实（注：作者发表本文是在1987年）。普通羊肚菌营养菌丝的营养需求有大量的文献支撑。羊肚菌子囊果个体发生的研究只能通过对采集到的野生子囊果进行分析。Greis（1940）的观点认为：胞质融合发生在子囊果发育的晚期，例如：子囊形成前的子囊层亚层细胞中，形态学分化的细胞进行融合，进而形成一个短的产囊细胞，产囊细胞中具有配对的细胞核（这里并不清楚是否在这两个融合的细胞之间只能形成一个子囊）。产囊菌丝的顶端形成子囊细胞，这里并不形成钩状细胞（锁状联合）。子囊的细胞学发育过程和其他子囊菌一样，形成八个子囊孢子。Falck（1920）和Buller（1934）对子囊孢子的释放进行过研究。

本文将对羊肚菌的培养特性进行深入的分析，包括观察来自不同子囊果的单孢分离物的培养特性。

本实验所用的子囊果采集自1966年和1967年春季的三个地点，三组被标记为GB，B和K。每个地点都收集有多个子囊果。采集的子囊果在潮湿的盒子内放置几天时间，以便其成熟，之后通过在琼脂平板上约1~3cm处悬挂一块菌盖组织保持约1~30分钟，在琼脂平板上得到自由弹射的孢子，之后琼脂平板进行24小时的培养观察，每一组收集25~30个单孢萌发菌丝物转移到PDA斜面培养基上保存备用。

子囊孢子的萌发试验：迄今对孢子萌发还没有相关的培养知识，因此对GB组进行多种培养基筛选萌发试验。包括2%麦芽浸出物琼脂培养基，0.3%酵母浸出物滤纸琼脂培养基和2%的细菌琼脂培养基。培养温度为8和20摄氏度，24小时之后进行检查分析。孢子在前两种培养基上，20摄氏度的条件下，能实现百分之百的萌发。B和K组的孢子在2%的麦芽浸出物琼脂培养基上，20摄氏度培育24小时之后也能达到将近百分之百的萌发率。

GB组的菌落特征：这一组得到的25个菌株表现被证明是不太正常的，25个菌株在继代培养之后并不能很好的生存下去。例如，他们表现出有限的生长潜能。为了精确的验证每一个菌株的生长受限情况。25个菌株中的19个菌株进行了“测速管”培养试验，从接种第二天开始进行连续17天的观察记录。19个菌株之间，其中有3个不能生长，2个有一丁点的生长，剩余的菌株以每天12~14毫米的生长速度均匀的生长，直到第11天。这些菌株之间，3个菌株从第11天开始到17天，生长速度变慢；剩余的以先前的速度持续生长。

对连续培养的菌株在停止生长时候，对菌落的边缘的菌丝进行显微观察发现，对比终止生长前的菌丝而言，菌丝顶端的细胞壁依旧完好，但是缺乏细胞核和细胞质。

菌丝的生长终止是一件令人费解的事情，如果以线性生长速度作为是生长指数，生长速度减缓是不连续的，毫无规律可言。然而，如果用生长密度作为生长指数，生长减缓就变得更加有规律可言。在菌丝线性生长终止之前的这一阶段内，菌落密度稳定性的下降是由于菌丝分支或短分支频率的降低所致。

B和K组：上面这种生长受限的情况使得GB组菌株不能用于后续的任何出菇试验。因此，在第二年，获得了B和K组210个单孢菌株，这些菌株没有表现出生长受限的情况，但也没有一个产生子囊果。

为了确定是否单孢培养物不育是由于异核体真菌的自我不亲和性所致，我们做了几百组配对试验，这些配对杂交包括：子实体内部群体杂交，例如：来自于相同子囊果的单孢群体之间的杂交；子囊果之间的杂交，组分内的杂交和组分间的杂交。

尽管没有任何一组形成子实体，但当两种类型的菌落相遇的时候出现同一种反应形式。如果配对的两个菌落是同一个单孢培养物，菌落交接处就和菌落的其他部位没什么两样（图1A和D）；在所有的非自我反应中，在菌落的交界处气生菌丝就会集结形成栅栏组织，无论是来自同一个子囊果（图1B和E）、还是不同的子囊果的单孢分离物之间（图1C和F）。这样的结果表明，1）子囊融合的细胞核是具有一定遗传因素的杂合子，2）单个子囊果得到的子囊孢子并非都是形成自相同配对的细胞核。

其他的一些菌落特征：我们的细胞学观察也表明，菌丝是有隔的，多细胞核的。在所有的菌丝培养中没有观察到分生孢子或其他任何形式的无性孢子。尽管很多菌株都形成菌核，但菌核的大小和数量变化比较大。菌丝类型可以明显的区分两类：1）绒毛状菌落类型，（图1A），特点是毛绒绒的气生菌丝；2）颗粒状菌落类型（图1D），特点是气生菌丝比较少。在所有的单孢培养物中，这两种类型的数量是持平的。在不同的子囊果得到的群体之间，这种表型不尽相同。一些子囊果进行成绒毛状菌落的单孢群体，一些子囊果得到的单孢群体这两种类型的菌落接近一比一，而另一些子囊果得到的单孢群体大多都是颗粒状菌落类型。这样的结果再一次表明（但不是证明）普通羊肚菌在某个生活史阶段形成异核体。没有单一子囊得到的子囊孢子的分析，因此就没有关于异核体更进一步的结论。

通过各种自然和合成培养基，以及在不同温度下进行培养，都没有得到任何子囊果。这种阴性的结果，对比为数不多的半人工栽培报道表明，我们在可控的实验室条件下还没有执行羊肚菌出菇的所有必须条件。众所周知，羊肚菌出菇发生冷气候区域带内，在春季的一个很短暂时间内当土壤温度回升到10摄氏度的时候。如果像我们实验结果表明的那样，子囊孢子并没有休眠阶段，他们可以在土壤温度在夏季达到20摄氏度的时候萌发和生长，菌核经历寒冷的冬季，在来年春天来临的时候，作为能源供给组织为出菇提供营养。我们没有通过试验获得子囊果的发生，因此不能得出到底普通羊肚菌是同宗结合还是异宗结合。

总结与点评：

1，         孢子萌发率。合适的培养基20摄氏度培育，普通羊肚菌的子囊孢子萌发率可以达到100%。子囊孢子没有休眠阶段可以在弹射后直接萌发。

2，         子囊孢子之间的配对组合全部有拮抗现象发生，且这种拮抗发生在同一子囊果得到的子囊孢子之间，也发生在不同子囊果之间。自我配对没有拮抗现象。这种现象不太好解释，涉及到迄今都没有解决的问题：羊肚菌到底是同宗结合还是异宗结合，也可以简单地说，羊肚菌的子囊孢子是同核体还是异核体。1）如果说子囊孢子都为异核体（杂交配对就属于体细胞不亲和类型，由体细胞不亲和位点所决定是否产生拮抗现象，表现形式为如果体细胞不亲和位点一样，则杂交配对不产生拮抗线；如果体细胞不亲和位点有一个不一样，则表现出不亲和现象。通常情况下，体细胞不亲和位点的数量比较多）。作者进行了几百组的配对试验，不应该都表现出拮抗的结果，至少应该会有一些，但因为体细胞不亲和位点比较多，也有可能出现作者描述的情况，大家都不一样。这可能是作者实验结果的最有可能解释。2）如果子囊孢子都为同核体（拮抗则属于交配型因子所导致的不亲和反应，按理说应该形成不同的拮抗类型），一个假设的过程是：一个子囊形成八个子囊孢子，亚子囊中的两个/两类细胞核进行配对，细胞核融合形成一个杂合2倍体细胞核，之后进行减数分裂形成两个单倍体细胞核，再经过两次有丝分裂形成八个单倍体细胞核，之后单独进入到八个子囊孢子中，在子囊孢子中经过有丝分裂达到一个子囊孢子具有多个细胞核的最终状态。如果按照这种假设，每一个子囊形成的八个子囊孢子应该是两种类型的同核体。也就不至于作者所得到的，全部之间形成拮抗现象。实际上这种推论是不合理的。3）如双孢蘑菇一样，孢子子代中既有同核体也有异核体，则产生的现象也应该如上面一条所述，不至于全部都产生拮抗现象。4）最后一个假设：作者的试验方案有瑕疵，在挑取单孢萌发物的时候，可能得到的所谓的单孢萌发菌落已经是杂合的异核体。以至于产生大量的异核体不亲和现象。

3，         菌丝生长受限。这是羊肚菌菌丝生长受限的首次描述，也是为数不多的一次。像动物细胞系细胞株一样，连续培养几十代之后就会出现细胞退化死亡的现象。但作者在文中没有对这种现象做深入的解释。我们也观察到了这种现象。

1978 菌丝老化 羊肚菌.zip