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国家卫健委和国家中医药管理局联合印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)》出院标准与第八版相比有较大更新:连续两次新型冠状病毒核酸检测N基因和ORF基因Ct值均≥35(荧光定量PCR方法,界限值为40,采样时间至少间隔24小时),或连续两次新型冠状病毒核酸检测阴性(荧光定量PCR方法,界限值低于35,采样时间至少间隔24小时)。
那么,Ct值是什么?
一、科普先森记者采访上海市免疫学研究所副所长、中国细胞生物学会科普工作委员会主任委员李斌的解答
新冠病毒核酸检测绝大多数采用荧光定量PCR方法,对病毒RNA运用逆转录后PCR的方式扩增目的序列进行检测。 荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光报告系统,利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控,实现对起始模板的定量检测。因为有扩增的过程,所以核酸检测方法通常准确性很高。 这一检测方法是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术,它通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。 核酸Ct值是什么意思呢?
Ct值,C代表Cycle,t代表Threshold,又称循环阈值,是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值,是循环数。Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
核酸检测的方法是将病毒的基因指数扩增,一个变两个、两个变四个、四个变八个,2的10次方是1024,2的20次方是100万,2的30次方10亿,2的40次方是1万亿,CT值=40,表示该病毒样本基因放大2的40次方,即经历40回合的几何级数放大后,侦测到荧光值可达到阈值。 Ct值代表人体内的病毒含量的多少。简单地说,就是在做核算检测时,检测仪器需要把病毒样本基因放大到一定程度才能侦测到病毒。病毒核酸浓度越高,荧光强度越高,循环阈值CT越小。 Ct值越小: 说明循环次数越少,用的时间越短,不用放大多少倍就能检测到病毒。这代表病毒浓度越高,越容易被侦查到。 Ct值越高: 代表需要越多时间与循环,病毒需要放大很多倍才能被侦测到,CT值越高代表病毒含量较少。 二、“知乎”网站昵称为“药渣王(海外药物化学博士)的通俗解惑 Ct值,全名叫Cycle threshold,即循环数阈值,在核酸检测中是个很重要的概念,我们以荧光定量PCR的核酸检测为例。 一般意义上,核酸检测就是采集咽拭子或者鼻拭子等(血液)体液样品,然后通过仪器检测里面含有的病毒数,如果样品中有病毒或者病毒数目太多(超过一定值),就说明这人感染了病毒,此刻定义为阳性,反之阴性。 现实情况是,即使一个人感染病毒并出现了症状,体液中病毒的含量其实也并不多,不多数量的病毒无法引发可侦测到的荧光,就导致定义阳性非常困难。咽拭子采样量本来就不大,加之采集之后的溶解等步骤会损失一部分样品(病毒数)。直接检测问题重重。那么怎么办呢?让病毒体外繁殖扩增,到足够的数量再检测吧。 简单就是,数个病毒不足以引起看得见的荧光,那我们让病毒扩增无数倍,然后成千上万的病毒引起的荧光我们总能看见吧 所以PCR(polymerase chain reaction)聚合酶链反应就登场了。PCR的原理非常简单,就是通过聚合酶链这种化学反应,在体外负责病毒RNA的扩增。 这儿需要补充一点,PCR扩增的其实不是完整的病毒,而是只扩增病毒的遗传物质,即核酸RNA,核酸检测的名称就是这么来的。如下图,一个病毒由蛋白和核酸RNA等物质构成。蛋白组成比较复杂,但一个病毒肯定有一套RNA,病毒感染机体也主要是复制自己的遗传物质RNA。所以检测病毒RNA数就等于是检测病毒数,RNA数和病毒数,这儿可以看成同一回事。 既然感染者样品中的病毒量还是太少,就先用PCR扩增到数目足够再检测。PCR扩增是指数级增长的。比如有1个病毒(即一套RNA),那么扩增一次即1个循环,就是2个;紧接以2个为基础,扩增第2个循环,就是4个(2的2次方);继续扩增第3个循环,就是8个(2的3次方);然后16个,以此类推,扩增n个循环,就是2的n次方。注意这个n,其实就是Ct值。 一个人感染了一个病毒但他本人还没表现出症状时,怎么区分他是阳性还是阴性呢?举个例子:用PCR扩增咽拭子样品,当Ct等于30,即扩增了30个循环时,这时候还没有看到足够量的病毒数(RNA数)所导致的荧光,即阴性。 但如果我们不放心,那么让PCR仪器继续工作,增大循环Ct到100次,这顿猛如虎的操作下来一看不得了,病毒核酸数直接扩增了100代。此时病毒RNA数量达到了检测所需的最低值,仪器出现了可见的荧光。然后“惊喜”雀跃,果然又一个阳性,这人得了新冠。哎呀,差一点都漏诊了。 看,这儿就有个问题,怎么科学的定义Ct值呢。其实对于健康的人体,比如A在空气中感染一个或者几个病毒,并不一定得新冠(有症状),因为强大的自身免疫系统会趁着病毒还没开始复制自己(就像PCR一样在体内复制),就已经把这几个小病毒清除了。 但是,如果此时我们核酸检测,然后,只要把Ct值调的无限大即扩增很多的倍数,是不是也能检测出病毒引发的荧光反应了?因为足够大的Ct循环数让原本一两个病毒的RNA繁衍2的n次方倍,终于达到了足以引发荧光的数量。接着呢,虽然A没什么症状也不会传染大概率会自愈,依然要果断定义A为阳性?因为不管怎么说,核酸检测结果就是阳性呀,只要我不说我用的是多大的Ct值就行。 这样看来,感染病毒和阳性之间,感染病毒和症状之间,如果抛弃了Ct值,是不是就很难界定了?我在门把手上采集样品,然后把Ct值调的无限高试试? 所以在新冠的核酸检测中,首先是确定Ct值,才能更精准的用于新冠肺炎筛查。
文献参考:科普先森微信公众号 知乎 等
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GMT+8, 2024-11-25 15:32
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