博文
实例图解简并引物设计（By Raindy）
|||
【絮语】
设计一对合适的引物是PCR扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成，却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y病毒CP基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、童鞋批评指正。
【相关工具】
（1）MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑
（2）DNAMAN8-检测两引物的互补性
（3）Oligo Calc-评估引物的属性
（4）Web Logo 3-直观显示简并碱基
-----------------------------------------------【华丽分割线】-----------------------------------------------
【基本原则】
设计一对好的引物，归结起来就是5′端引物、3′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：
（1）两引物的序列要与模板的序列紧密互补；
（2）两引物不能在模板的非目的位点发生错配；
（3）两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。
【延伸原则】
（1）引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合DNA聚合酶反应；
（2）GC含量：一般介于40%-60%之间，且两个引物之间的GC含量相差不能过于悬殊；
（3）碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的GC，GC富集区容易导致错误引发反应。
【特别注意】
5′端引物的作用主要限定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从3′端开始的，所以3′端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考虑以下几个内容：
（1）不要终止于密码子的第 3 位
（2）末位碱基避免使用碱基 A
（3）避免出现3个以上连续的G或C，如GCG或CCC或GGG
（4）ΔG的绝对值不可超过 9
（5）与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8个互补碱基同源
（6）不能进行任何修饰
----------------------------------------------------【华丽分割线】-------------------------------------------------
【设计流程】
-----------------------------------------------【华丽分割线】-----------------------------------------------
【基本原则】
设计一对好的引物，归结起来就是5′端引物、3′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：
（1）两引物的序列要与模板的序列紧密互补；
（2）两引物不能在模板的非目的位点发生错配；
（3）两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。
【延伸原则】
（1）引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合DNA聚合酶反应；
（2）GC含量：一般介于40%-60%之间，且两个引物之间的GC含量相差不能过于悬殊；
（3）碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的GC，GC富集区容易导致错误引发反应。
【特别注意】
5′端引物的作用主要限定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从3′端开始的，所以3′端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考虑以下几个内容：
（1）不要终止于密码子的第 3 位
（2）末位碱基避免使用碱基 A
（3）避免出现3个以上连续的G或C，如GCG或CCC或GGG
（4）ΔG的绝对值不可超过 9
（5）与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8个互补碱基同源
（6）不能进行任何修饰
----------------------------------------------------【华丽分割线】-------------------------------------------------
【设计流程】
实例操作：
请访问科学网论坛-《实例图解简并引物设计（By Raindy）》
http://bbs.sciencenet.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1280587&fromuid=460481
如果论坛也无法下载，请移步我的网盘-生信教程目录下载：http://raindy.ys168.com/
https://blog.sciencenet.cn/blog-460481-737216.html
上一篇：贝叶斯法重建系统发育关系
下一篇：基因的选择压力检测及检验图解教程（By Raindy）
