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(1) 凝胶柱的装填
将层析柱(Φ2.6×20cm)于地面垂直固定在架子上,下端流出口用夹子夹紧,柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器,柱内充满洗脱液,将溶胀后的DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶调成较稀薄的浆液盛于柱顶的容器中,然后在轻微搅拌下使凝胶下沉于柱内,这样凝胶粒水平上升,直到所需高度为止,拆除柱顶装置,稍放置一段时间,再开始流动平衡,流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速。平衡凝胶床约两倍柱体积左右,使用前要检查层析床是否均匀,有无“纹路”或气泡,或加一些有色物质(如蓝色葡聚糖)来观察色带的移动,如果色带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好,色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
注意:层析柱一定要配套的,不可混用,如果出现漏液及气泡,只能重新装柱,会很浪费时间的。我就是因为柱子不配套,柱子一个一个拆开,排查原因,换配件,耽误了很长时间。柱子装好后,平衡时一定要时刻观察,防止出现气泡及漏液,一旦出现状况立即解决,若在进样时出现问题,将会让你很崩溃的~
(2) 上样
取粗多糖样品0.1g,用超纯水溶解,配成浓度为10mg/ml的溶液,过0.45μm滤膜后上DEAE-Sepharose
Fast Flow柱(Φ2.6×20cm),流速为1mL/min,用部分收集器收集洗脱液,每5ml收集一管,洗脱至洗脱液没有多糖检出为止。
注意:开始时,我使用此条件进行摸索的,先用蒸馏水进行洗脱,直至没有糖检出为止,然后设置不同的氯化钠浓度梯度,进行洗脱。条件摸索完之后,然后可以进行多次大量的纯化,收集所需要的组分峰。
a、用苯酚-硫酸法测定其中的多糖含量。以管数为横坐标,以吸光度为纵坐标,得到多糖的洗脱曲线,并分别收集不同洗脱峰各管洗脱液。
b、在280nm的紫外分光光度计测每管的吸光度值,以管数为横坐标,以吸光度为纵坐标,得到蛋白质的洗脱曲线。
在用阴离子交换层析柱纯化多糖过程中,以不同离子强度的盐溶液洗脱,分部收集洗脱液,合并多糖单一峰部分,透析,浓缩。
(3)凝胶的再生
可以用氢氧化钠进行再生,然后用蒸馏水洗至中性即可,经过实验验证,对分离效果没有影响。
(4) 凝胶柱的保存
一次装柱后可以反复使用,不必特殊处理,并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌,可在层析后加入0.02%的叠氮钠,在下次层析前应将抑菌剂除去,以免干扰洗脱液的测定。另外可以用20%的乙醇进行保存,4℃冰箱储存即可。
祝大家实验进展顺利!并欢迎大家就此进行交流学习!
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GMT+8, 2024-11-22 22:49
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