Genomics, Proteomics & Bioinformatics（GPB）在线发表了由云南师范大学生命科学学院黄遵锡教授、中山大学生命科学学院李文均教授和中国地质大学（武汉）蒋宏忱教授课题组合作的题为“Gut Microbiome Variation Along A Lifestyle Gradient Reveals Threats Faced by Asian Elephants”的研究论文。文章第一作者云南师范大学青年教师张呈波博士为大家解读如何在肠道微生物组领域探究保护亚洲象的新思路。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1672022923000694

1-s2.0-S1672022923000694-main.pdf

要点介绍

研究问题：

西双版纳野象谷的亚洲象肠道微生物群如何沿着生活方式梯度发生变化？亚洲象肠道微生物群哪些细菌类群显著受到生活方式梯度变化的影响？亚洲象肠道微生物群与宿主营养和健康相关的基因含量随生活方式梯度如何变化？

研究方法：

本研究对亚洲象新鲜粪便样本进行了16S rRNA 扩增子基因测序。测序结果经 α 多样性分析，发现随着圈养程度的增加，亚洲象肠道细菌群落多样性显著降低； β 多样性分析发现不同生活方式亚洲象肠道微生物群落组成存在显著差异，其中细菌类群 WCHB1-41_c 受生活方式变化的影响是显著的；功能预测分析显示，与生活方式变化显著相关的主要功能包括代谢途径、次生代谢产物的生物合成、氨基酸的生物合成等，它们从完全圈养到野生组逐渐富集；丁酸产生菌的丰度分析和 BCoAT 基因的 qPCR 定量分析结果表明，纯野生亚洲象的潜在健康状况面临着问题。

主要结果1：

随着圈养程度的增加，亚洲象肠道细菌群落多样性显著降低。

主要结果2：

不同生活方式亚洲象肠道微生物组成存在显著差异。

主要结果3：

受生活方式变化影响显著的细菌类群及其代谢途径分析。

主要结果4：

野生生活方式存在对亚洲象健康的不利因素。

数据链接：

https://ngdc.cncb.ac.cn/search/?dbId=&q=CRA007093

背景和研究对象

肠道微生物群落与哺乳动物形成紧密的关系，有助于宿主生理过程、免疫反应和营养代谢。特别是，草食性哺乳动物依靠其特定的肠道微生物类群从食物中提取营养和能量、合成维生素和解毒植物防御化合物。正常的肠道微生物-宿主关系通过健康稳定的饮食、均质地理环境以及长期持续和无波动的生活方式等暴露途径得以维持。这些关系被扰动会导致疾病。而且，很难将饮食和地理因素与生活方式区分开来。因此，了解生活方式如何以及在多大程度上影响宿主肠道微生物仍然是一个巨大的挑战。

大量研究表明，动物生活方式的变化将极大地改变其肠道菌群。野生动物被转换为圈养的生活方式后，它们必须应对剧烈的变化，如活动范围受限、饮食单一以及特定社交网络的丧失，这些非自然条件变化会干扰动物肠道微生物群的多样性和组成。有研究结果显示，圈养宿主的肠道微生物多样性相对于野生宿主有所下降，然而，也有研究得出了不同的结果，这些矛盾的研究结果表明需要更多的对照研究来探索不同生活方式对动物肠道微生物的深入影响。已有研究表明生活方式的改变会导致肠道微生物多样性和组成的改变，可能对野生动物的营养和健康产生影响。因此需要研究了解宿主的生活方式与肠道微生物群组成之间的相互作用，这有助于野生动物的保护。

亚洲象被列为中国国家一级重点保护野生动物，已被世界自然保护联盟（IUCN）列为濒危物种。野生亚洲象多数分布在中国云南省南部，种群数量为 288 ~ 338 只。云南西双版纳野象谷生活着四种不同生活方式的亚洲象，分别为圈养、半圈养、半野生和野生。这四种生活方式是极其罕见的，因为其系统发育物种单一、生活的地理环境均质以及饮食逐渐变化，更重要的是，四种生活方式一直如此保持了几十年。因此，在四种生活方式中研究亚洲象的肠道微生物组可以帮助了解生活方式如何逐渐影响肠道微生物群的进化。

我们基于对亚洲象觅食植物种类的调查，对 16S rRNA 基因序列进行系统发育分析，发现随着圈养程度的增加，亚洲象肠道微生物多样性逐渐降低。此外，研究结果表明，细菌类群 WCHB1-41_c 受到生活方式梯度变化的影响显著。我们利用 qPCR 定量分析，发现纯野生亚洲象肠道微生物组与丁酸盐产生相关的基因少，表明野生生活方式存在对亚洲象健康的不利因素。这些结果将为提升圈养象的饲养管理和预防野生象的异常迁徙提供理论指导。

结果

随着圈养程度的增加，亚洲象肠道细菌群落多样性显著降低

为了阐明在没有混淆地理差异的情况下，长期持续的不同生活方式如何影响它们的肠道微生物组，我们关注了一种独特的同域系统发育物种—亚洲象。亚洲象觅食植物的调查结果显示，四种生活方式亚洲象的觅食植物种类多样性随着圈养程度的增加而降低；中性洗涤纤维的平均含量随着圈养程度的增加而增加。亚洲象粪便样本的 16S rRNA 基因系统发育分析表明，亚洲象肠道细菌群落的 α 多样性随着圈养程度增加而逐渐降低。因此，肠道细菌多样性随圈养程度而降低的主要决定因素是觅食植物种类的减少，而不是饮食中纤维含量的变化。

图1 亚洲象肠道细菌α多样性沿生活方式梯度的变化及维恩分析

不同生活方式亚洲象肠道微生物组成存在显著差异

通过基于 OTU 水平 Bray - Curtis 距离的主坐标分析（PCoA），发现肠道细菌群落通过不同的生活方式明显聚集（PERMANOVA；R² = 0.3017，P = 0.001），多维空间中细菌群落明显分离（图 2A 和 B）。表明无论微生物类群之间的进化关系如何，四种生活方式之间的肠道微生物组成都存在显著差异。

尽管基于 weighted_uniFrac 距离的 PCoA 分析显著区分了不同生活方式亚洲象肠道微生物群落的组成（PERMANOVA；R² = 0.3391，P = 0.001；图 2C 和 D），然而自由觅食生活方式亚洲象（半圈养、半野生和野生）和完全圈养生活方式之间的 weighted_uniFrac 距离没有显著差异（Kruskal−Wallis，P = 0.59；图 2E）。这表明生活方式梯度可能不会促进亚洲象肠道菌群的进化差异。

此外，使用 Unweighted_uniFrac 距离的 PCoA 分析表明，不同生活方式亚洲象的肠道微生物组成存在显著性差异（R² = 0.2774，P = 0.001）。然而，涉及圈养（包括圈养，半圈养和半野生）的生活方式亚洲象样本彼此聚集，即与野生生活方式分开（图 2F）。沿着 PC1，完全圈养、半圈养和半野生生活方式的亚洲象肠道微生物组成相似，与纯野生生活方式亚洲象有显著差异（P = 0.001；图 2G）。自由觅食生活方式亚洲象（半圈养，半野生和野生）与完全圈养生活方式的 unweighted_uniFrac 距离随着野生生活方式程度的加深而显著增加（Kruskal-Wallis，P = 0.00013；图 2H）。在 OTU 水平上，自由觅食生活方式亚洲象（按半圈养、半野生和纯野生的顺序）与完全圈养生活方式之间的相似性百分比（SIMPER）差异明显增加（图 2I）。

图2 不同生活方式亚洲象的β多样性分析

受生活方式变化影响显著的细菌类群及其代谢途径分析

基于 SIMPER 分析，四种生活方式亚洲象肠道微生物群门水平上的差异贡献物种分别是 Firmicutes，Fibrobacteres 和 Proteobacteria，科水平的差异贡献物种是 Lachnospiraceae，Spirochaetaceae，Rikenellaceae，Fibrobacteraceae，Ruminococcaceae，Prevotellaceae，Bacteroidales_BS11，Porphyromonadaceae 和 WCHB1-41_c（图 3B）。基于线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析，Fibrobacteraceae 和 Bacteroidales_BS11 是完全圈养组中的生物标志物细菌类群，Verrucomicrobia 中的 WCHB1-41_c 是完全野生组中的生物标志物细菌类群（图 4）。通过 WGCNA 分析，发现 2 个丰度共变化组（CAG2 和 CAG8）与亚洲象生活方式变化显著相关（图 5A 和 5B）。SIMPER，LEfSe 和 WGCNA 分析的综合结果表明，细菌分类群 WCHB1-41_c 受生活方式梯度变化的影响显著。

PICRUST2功能预测分析显示，与生活方式变化显著相关的主要功能包括代谢途径、次生代谢产物的生物合成、氨基酸的生物合成等，它们从完全圈养到野生组逐渐富集（图5C）。

图5 受生活方式变化显著影响的细菌类群和代谢途径分析

野生生活方式存在对亚洲象健康的不利因素

为了评估生活方式差异对动物健康的影响，我们分析了产生丁酸盐的肠道细菌丰度。亚洲象肠道中产丁酸菌主要由 Butyrivibrio 和 Pseudobutyrivibrio 组成。qPCR 分析结果显示，在完全圈养、半圈养、半野生和野生生活方式的亚洲象个体中，靶基因丁酰 CoA 转移酶基因（BCoAT）的平均相对表达水平随着圈养程度的增加而逐渐降低（从半野生和半圈养组到完全圈养组，图 6B）。四种生活方式亚洲象之间的 BCoAT 基因相对表达水平存在显着差异（Kruskal-Wallis，P = 0.01779；图 6B）。这些结果与优势菌组成（包括食物消化细菌）分析（图 3；图 S3）相结合，可以为不同生活方式的亚洲象的健康提供重要参考。

四种生活方式组的 dsrA 基因含量没有明显差异（Kruskal–Wallis，P > 0.05；图 6C），表明四组之间硫酸盐还原菌产生硫化氢的能力没有显着差异。

一般来说，丁酸盐促进肠道发育和健康，而硫酸盐还原菌对氢的利用效率较低，它们的最终代谢产物硫化氢可引起癌变和炎症。在我们的研究中，尽管 dsrA 基因的相对含量在四种生活方式中没有显着差异，但功能性 BCoAT 基因的相对含量从完全圈养到半野生个体呈增加趋势，并且在野生个体中最低（图 6B），这表明野生生活方式存在对宿主健康的不利因素。与野生生活方式相关的这些不利因素（如食物和栖息地等资源可利用性减少）的进一步研究将有助于探究导致野生亚洲象北迁的原因。

图6 丁酸盐产生菌丰度分析以及BCoAT和dsrA基因定量分析

总结

我们的研究结果表明，圈养亚洲象的微生物群多样性降低是一个既定事实，而食物和栖息地等资源可用性降低的不利因素的增加是影响纯野生亚洲象的重要问题。这项研究为开发保护亚洲象的新技术和新工具提供了基础，将更好地评估人类活动对野生亚洲象健康的影响以及应对野生亚洲象异常迁徙所面临的挑战。

（原作者授权发布）