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Oncogene:ULK1依赖的PKM2磷酸化拮抗O-GlcNAc糖基化修饰并抑制乳腺癌的机制研究

已有 579 次阅读 2024-4-19 09:06 |系统分类:论文交流

    UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)是己糖胺生物合成途径的产物。氧连接的N-乙酰葡糖胺(O-linked β-N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)修饰是由O-GlcNAc转移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)将UDP-GlcNAc转移到对应靶蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基上的一种单糖修饰;而OGA则负责去除该修饰。O-GlcNAc修饰经常与其他翻译后修饰发生串扰,比如磷酸化修饰,将代谢与细胞信号转导耦联,协调多种生物学过程。Warburg效应,又称为有氧糖酵解,是一种在癌细胞中观察到的代谢重编程现象——癌细胞即使在氧气充足的情况下,也倾向于通过糖酵解而不是线粒体的氧化磷酸化来产生能量。丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2,PKM2)是推动肿瘤生长中Warburg效应的关键代谢酶。以往的研究表明,PKM2的S362/T365/T405/S406会发生O-GlcNAc糖基化修饰。

    2024年4月17日,首都师范大学的李静教授,深圳大学许兴智教授以及清华大学徐泉教授团队在Oncogene上发表了题为“ULK1-dependent phosphorylation of PKM2 antagonizes O-GlcNAcylation and regulates the Warburg effect in breast cancer”论文,报道了ULK1依赖的PKM2磷酸化拮抗O-GlcNAc糖基化并抑制乳腺癌中的Warburg效应。

    UNC-51样激酶1(ULK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,以自噬的启动作用而闻名。ULK1已被证实是细胞能量和营养感应激酶的直接靶点,响应细胞资源的分配和利用,并在多种疾病比如癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和感染等发挥关键作用。在之前对 ULK1蛋白的 O-GlcNAc 糖基化修饰的研究中,研究者发现 PKM2 存在于 ULK1 的免疫沉淀物中,这提示 ULK1 可能调控 PKM2。

    为了探索PKM2上潜在的磷酸化位点,作者进行了体外激酶实验。重组的PKM2蛋白被ULK1有效地磷酸化(图1A)。然后通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析了体外激酶产物,只有Ser333符合ULK1的保守位点(图1B-C)。接下来通过体外激酶实验,发现重组的GST-PKM2-S333A磷酸化信号大大减弱(图1A)。接着,作者制备了针对PKM2-pS333的磷酸化特异性抗体,其条带在PKM2-S333A免疫沉淀物和经磷酸酶处理的PKM2-野生型免疫沉淀物中下调(图1E-G)。第三,使用雷帕霉素来上调自噬,这显著增加了pS333的水平(图1H-I)。因此,作者发现ULK1依赖的PKM2磷酸化主要发生在S333位点。

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图1. ULK1磷酸化PKM2蛋白的S333位点

    作者提出如下猜想:即对葡萄糖敏感的S333磷酸化是否与其O-GlcNAc修饰之间有串扰。通过用OGA抑制剂——Thiamet-G(TMG)加葡萄糖处理细胞,作者富集了细胞裂解物中的O-GlcNAc修饰。如图2A-B所示,磷酸化缺陷的S333A突变体增加了O-GlcNAcylation水平,而磷酸化模拟的S333D突变体减少了O-GlcNAcylation水平。那么O-GlcNAcylation水平的变化是否是由于PKM2与OGT之间的结合发生变化呢?因此他们测试了OGT与PKM2-WT及突变体之间的相互作用。外源性的Flag-PKM2-S333A显示出与HA-OGT结合的适度增加(图2C-D)。Flag-PKM2-S333A与内源性OGT的结合显著增加(图2D)。GST-OGT也增加了与Flag-PKM2的相互作用(图2)。作者还测试了O-GlcNAcylation是否与pS333有串扰,通过构建PKM2-S362A/T365A/T405A/S406A突变体。但该突变体并未显示出pS333水平的变化。这有可能是因为PKM2还有其他的O-GlcNAcylation位点。分子动力学模拟也没有揭示pS333与O-GlcNAcylation位点之间的任何相互作用。这些结果表明,PKM2的pS333拮抗O-GlcNAcylation,可能是由于与OGT的亲和力降低所致。

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图2. PKM2的S333磷酸化通过减少与OGT的相互作用拮抗O-GlcNAc修饰

    已知PKM2的O-GlcNAcylation会破坏PKM2四聚体的形成并降低其酶活性(PNAS, 2017)。作者随后研究了pS333的对PKM2上述功能影响。PKM2的S333A突变体和SBI处理都减少了PKM2的四聚体形成,降低了PK活性。以上结果提示,野生型PKM2的pS333促进了PKM2四聚体的形成并增强其酶活性。

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图3. PKM2的S333磷酸化抑制乳腺癌的进展

    为了研究PKM2的O-GlcNAc糖基化在体内的作用,作者在4T1小鼠乳腺肿瘤细胞中稳定表达了FLAG-PKM2-WT或FLAG-PKM2-S333A突变体(图3A),然后将它们皮下注射到BALB/c小鼠中并观察肿瘤的生长。结果显示,PKM2的过表达促进了肿瘤的生长,而缺乏磷酸化的S333A进一步促进了肿瘤的生长(3B-E)。免疫组化分析显示,在WT和S333A过表达的肿瘤中,Ki-67阳性的肿瘤细胞显著增加,而S333A进一步增加了这一比例(图3F-G)。这些结果共同支持了PKM2 pS333在异源移植肿瘤模型中抑制肿瘤生长的观点。

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图4. PKM2 S333磷酸化的作用的模型 Model depicting the role of PKM2 S333 phosphorylation.

ULK1 phosphorylates PKM2 at S333, which antagonizes PKM2 O-GlcNAcylation. PKM2 pS333 inhibits the Warburg effect and tumorigenesis in breast cancer.

    总的来说,本文发现了对葡萄糖敏感的PKM2-pS333这一新的磷酸化位点,它可以拮抗O-GlcNAcylation,S333磷酸化和O-GlcNAcylation之间的相互作用可能协调葡萄糖状态与癌症代谢。这项研究不仅揭示了PKM2的翻译后修饰在乳腺癌代谢重编程中的关键角色,还为癌症治疗提供了潜在的靶点。

摘要 Abstract

Pyruvate kinase M2 (PKM2) is a central metabolic enzyme driving the Warburg effect in tumor growth. Previous investigations have demonstrated that PKM2 is subject to O-linked β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modification, which is a nutrient-sensitive post-translational modification. Here we found that unc-51 like autophagy activating kinase 1 (ULK1), a glucose-sensitive kinase, interacts with PKM2 and phosphorylates PKM2 at Ser333. Ser333 phosphorylation antagonizes PKM2 O-GlcNAcylation, promotes its tetramer formation and enzymatic activity, and decreases its nuclear localization. As PKM2 is known to have a nuclear role in regulating c-Myc, we also show that PKM2-S333 phosphorylation inhibits c-Myc expression. By downregulating glucose consumption and lactate production, PKM2 pS333 attenuates the Warburg effect. Through mouse xenograft assays, we demonstrate that the phospho-deficient PKM2-S333A mutant promotes tumor growth in vivo. In conclusion, we identified a ULK1-PKM2-c-Myc axis in inhibiting breast cancer, and a glucose-sensitive phosphorylation of PKM2 in modulating the Warburg effect.

原文链接https://www.nature.com/articles/s41388-024-03035-y 

参考文献:

1. Zibin Zhou#, Xiyuan Zheng#, Jianxin Zhao#, Aiyun Yuan#, Zhuan Lv, Guangcan Shao, Bin Peng, Meng-Qiu Dong, Quan Xu*, Xingzhi Xu* and Jing Li* . ULK1-dependent phosphorylation of PKM2 antagonizes O-GlcNAcylation and regulates the Warburg effect in breast cancer. Oncogene (2024)  doi:10.1038/s41388-024-03035-y 

2. Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., and Lagerlof, O.  Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annu Rev Biochem (2011) 80, 825-858

3. Wang, Y., Liu, J., Jin, X., Zhang, D., Li, D., Hao, F., Feng, Y., Gu, S., Meng, F., Tian, M., Zheng, Y., Xin, L., Zhang, X., Han, X., Aravind, L., and Wei, M. O-GlcNAcylation destabilizes the active tetrameric PKM2 to promote the Warburg effect. PNAS (2017)  114, 13732-13737

相关博文:糖酵解关键酶PKM2的O-GlcNAc糖基化修饰研究 https://blog.sciencenet.cn/blog-446272-1359437.html 



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