肝纤维化是慢性肝病的常见病理特征，可进展至肝硬化和肝衰竭，与肝脏疾病的发生发展和预后密切相关。肝星状细胞（HSC）活化和胆汁酸（BA）失调在肝纤维化发展中发挥着重要作用，但肝细胞代谢紊乱和HSC活化之间的细胞串扰目前尚不清楚。近日，重庆医科大学的唐霓/ 陈昶/ 黄爱龙教授团队在Advanced Science上发表最新研究成果：发现溶质载体家族27成员5 (SLC27A5/ 也称为FATP5)的缺失抑制了胆汁酸结合，非结合胆酸（CA）作用于促纤维化转录因子EGR3，激活HSC进而参与肝纤维化进展，为阐明胆汁酸代谢失调在肝纤维化发生发展中的作用提供了新见解。

研究结果

1.SCL27A5在肝纤维化患者和小鼠模型中显著下调

    为了评估SLC27A5在肝纤维化发展中的作用，研究者分析了GEO数据库中肝纤维化患者和正常对照组中，肝活检标本的SLC27A5 mRNA表达水平，发现其显著下调；同时发现在HBV相关的肝纤维化患者中，SLC27A5表达水平随纤维化程度加重而逐步降低。在四氯化碳（CCl4）和硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝纤维化小鼠模型中，同样发现SLC27A5表达降低。研究者进一步利用JASPAR数据库分析了在肝纤维化中负责下调SLC27A5的潜在转录因子（NR2C2、REST、RXRA、HNF4a和RUNX2）。在肝纤维化小鼠的肝组织中RUNX2 mRNA水平显著上调，而HNF4a和REST变化不大（图1C）；在肝硬化和纤维化患者和模型小鼠的肝组织中均观察到RUNX2表达显著升高（图1D）。随后进一步研究发现，SLC27A5的下调依赖于转录抑制因子RUNX2。

图1 SCL27A5在肝纤维化患者和小鼠模型中表达显著下调

2.SLC27A5缺陷加重肝纤维化小鼠的纤维化程度

     研究者利用CRISPR-Cas9技术构建了SLC27A5敲除（Slc27a5−/−）小鼠模型，发现和野生型（WT）小鼠相比，12月龄Slc27a5−/−小鼠出现肝组织损伤和炎症反应，24月龄Slc27a5 KO小鼠的肝组织病理呈肝纤维化表现，且促纤维化基因（Acta2、Col1a1、Col3a1、Timp1和Vim）和炎症基因（Tnfa、Il6、Il1β等）显著上调（图2），表明SLC27A5敲除导致小鼠自发出现肝纤维化。

图2 SLC27A5缺陷小鼠出现自发性肝纤维化

    随后，构建了CCl4或TTA诱导的肝纤维化小鼠模型，与WT组相比，Slc27a5−/−肝纤维化模型小鼠中肝组织化学染色呈现胶原沉积增多、纤维形成和巨噬细胞浸润升高等（图3）。以上发现表明，SLC27A5缺乏加剧了小鼠模型中的肝纤维化。

图3 SLC27A5缺陷加重肝纤维化小鼠的纤维化程度

3.非结合胆酸（CA）升高激活Slc27a5−/−小鼠的HSC

    胆汁酸结合所必需的SLC27A5在调节肝脏胆汁酸稳态中起着重要作用。既往研究发现，SLC27A5 缺陷会导致非结合性胆汁酸，特别是CA在肝脏中聚积。研究者分析了24月龄的Slc27a5−/−小鼠的胆汁酸成分，发现CA和脱氧胆酸（DCA）显著增加（图4A，B）。为了确定Slc27a5−/−小鼠BA升高是否有助于HSC的活化，研究者分别用浓度为25、50和100μM的CA或DCA处理人HSC细胞系LX-2，发现CA处理以剂量依赖性方式上调HSC活化标志物的表达。此外，在肝硬化患者中，CA而非DCA的血清水平显著增加（图4G）。与对照组相比，SLC27A5-KO MIHA细胞和原代小鼠肝细胞中的CA水平也明显升高。上述研究表明在肝纤维化小鼠和肝硬化患者中，非结合CA的异常升高均促进HSC活化。

图4 非结合胆酸（CA）升高可激活Slc27a5−/−小鼠的HSC

4.胆酸通过上调促纤维化转录因子EGR3来促进HSC活化

    为了研究CA如何诱导HSC的活化，研究者用50μM的CA处理LX-2细胞并进行转录组测序，发现经CA处理有效地增加了LX-2细胞中与纤维化相关基因的表达（图5A），其中促纤维化转录因子EGR3的表达上调最显著。随后用ChIP法证实EGR3在LX-2细胞中与ACTA2和COL1A1基因启动子结合，沉默EGR3后纤维化基因显著恢复，且免疫荧光发现shEGR3减弱了CA诱导的β-SMA表达（图5C-E）。值得注意的是，在原代小鼠HSC中，shEGR3处理同样抑制了α-SMA、COL1A1和COL3A1的上调（图5 F-H），进一步说明胆酸是通过上调EGR3来促进HSC活化，参与肝纤维化的发展。

图5 胆酸通过上调促纤维化转录因子EGR3导致HSC活化

 5.SLC27A5过表达或抑制小肠胆汁酸吸收减轻CCl4诱导的肝纤维化

    研究者进一步通过尾静脉注射AAV-Slc27a5在WT和Slc27a5^−/−（KO）小鼠的肝脏中特异性过表达SLC27A5，发现SLC27A5在KO小鼠中的再表达减轻了肝脏胶原沉积和纤维化程度。另一方面，研究者使用 A4250（顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白 ASBT 抑制剂）降低肝脏中CA水平，发现Slc27a5^−/−小鼠的肝纤维化程度改善。综上，SLC27A5 缺陷通过抑制胆汁酸结合，使其积累在肝脏中，进一步与EGR3作用来激活HSC，从而导致肝纤维化发生。

图6 SLC27A5过表达减轻CCl4诱导的肝纤维化

图7 抑制小肠胆汁酸吸收减轻CCl4诱导的肝纤维化

研究结论

    该研究发现SLC27A5缺陷通过抑制胆汁酸结合，使未结合的CA在肝脏中积累，其进一步通过EGR3激活HSC，从而导致小鼠肝纤维化。上述发现SLC27A5在纤维化进展中发挥重要作用，恢复肝细胞中SLC27A5的再表达以及抑制促纤维化的CA在肝脏中积累，可能是肝纤维化的潜在治疗策略。

科学假说图

摘要：

Although the dysregulation of bile acid (BA) composition has been associated with fibrosis progression, its precise roles in liver fibrosis is poorly understood. This study demonstrates that solute carrier family 27 member 5 (SLC27A5), also known as long-chain fatty acid transport protein 5 (FATP5), an enzyme involved in BAs metabolism, is substantially downregulated in the liver tissues of patients with cirrhosis and fibrosis mouse models. The downregulation of SLC27A5 depends on RUNX family transcription factor 2 (RUNX2), which serves as a transcriptional repressor. The findings reveal that experimental SLC27A5 knockout (Slc27a5−/−) mice display spontaneous liver fibrosis after 24 months. The loss of SLC27A5 aggravates liver fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCI4) and thioacetamide (TAA). Mechanistically, SLC27A5 deficiency results in the accumulation of unconjugated BA, particularly cholic acid (CA), in the liver. This accumulation leads to the activation of hepatic stellate cells (HSCs) by upregulated expression of early growth response protein 3 (EGR3). The re-expression of hepatic SLC27A5 by an adeno-associated virus or the reduction of CA levels in the liver using A4250, an apical sodium-dependent bile acid transporter (ASBT) inhibitor, ameliorates liver fibrosis in Slc27a5−/− mice. In conclusion, SLC27A5 deficiency in mice drives hepatic fibrosis through CA-induced activation of HSCs, highlighting its significant implications for liver fibrosis treatment.

参考文献：

Wu K, Liu Y, Xia J, Liu J, Wang K, Liang H, Xu F, Liu D, Nie D, Tang X, Huang A, Chen C, Tang N. Loss of SLC27A5 Activates Hepatic Stellate Cells and Promotes Liver Fibrosis via Unconjugated Cholic Acid. Adv Sci. 2023 Nov 13:e2304408.Epub ahead of print. PMID: 37957540. 

DOI:  https://doi.org/10.1002/advs.202304408

全文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202304408