N6-methyladenosine (m⁶A) 是mRNA上最丰富的转录后修饰，并在生理和病理过程中扮演着重要作用。研究表明，m6A的读码蛋白 (reader proteins) 决定了带有m6A修饰mRNA的命运。2014年以来，芝加哥大学何川实验室发表了一系列研究[1-3]，发现YTH家族蛋白（YTHDF）通过特异识别m6A，介导mRNA的降解 (YTHDF2/3) 和翻译 (YTHDF1/3) ，提出了YTHDF家族的三个蛋白差异化调控m6A功能的机制模型[4-5]。然而，也有实验室认为YTHDF家族的三个蛋白具有完全冗余的功能，提出YTHDF1/2/3仅介导m6A-mRNA的降解[6]。随后，在不同体系中的系列研究也得出截然不同的结论。因此，m6A生物学的关键基础即YTHDF蛋白的功能机制仍不明确。

    2023年11月9日，浙江大学林世贤/芝加哥大学何川/深圳湾实验室葛韵团队合作在Nature Cell Biology上发表题为"O-GlcNAcylation determines the translational regulation and phase separation of YTHDF proteins"的研究论文。该研究采用翻译后修饰的化学定量检测技术，解析了O-GlcNAc糖基化修饰水平对YTHDF蛋白的翻译促进功能与相分离性质的调控机制，提出了YTHDF1/3可逆调控m6A-RNA翻译的完善模型，解释了YTHDF蛋白功能研究争议的本质原因。

    蛋白质翻译后修饰广泛地存在于细胞中，极大地丰富了蛋白质组的多样性，并参与调控细胞的所有重要生理过程。通过对YTHDF蛋白的各种翻译后修饰水平进行质谱定量分析，研究人员发现仅在YTHDF1/3蛋白（而非YTHDF2蛋白）上鉴定到高丰度的O-GlcNAc糖基化修饰。有意思的是，该糖基化修饰的位点处于三种YTHDF蛋白序列的低同源区域，因此该修饰水平的差异应该是由YTHDF家族蛋白序列的差异导致[5]。

    研究人员进一步采用翻译后修饰的化学定量检测技术对YTHDF1/3的O-GlcNAc修饰水平展开细致的分析，发现在不同细胞系、细胞周期以及细胞环境下糖基化修饰的丰度存在着可逆地动态变化。功能机制的研究表明，高丰度的O-GlcNAc修饰干扰YTHDF1/3蛋白对翻译促进因子的招募，进而抑制其对m6A-RNA的翻译促进功能。而当O-GlcNAc修饰处于低丰度水平时，YTHDF1/3蛋白则能高效招募翻译促进因子，加速m6A-RNA的翻译。在不同研究体系中，因YTHDF1/3的糖基化水平变化大，所以已有的研究在测定YTHDF1/3是否促进m6A-RNA翻译功能上得出了截然不同的结论。

    更有意思的是，研究人员还通过系列的体外和体内实验发现O-GlcNAc糖基化修饰是调控YTHDF1/3的相分离组装、动态过程和解聚的关键因素。研究发现YTHDF1/3的高丰度O-GlcNAc修饰提高了其在相分离成分中的动态性，加速解聚相分离；而YTHDF1/3的低丰度O-GlcNAc修饰维持了其在相分离组分中的稳定性。这一机制保障了细胞更好的从应激状态恢复，并调控了m6A-RNA在相分离体系中的动态转运。

O-GlcNAc修饰可逆调控YTHDF蛋白的翻译促进功能与相分离性质

    总的来说，这项研究将定量检测技术应用于YTHDF蛋白翻译后修饰水平的分析，验证了YTHDF1/3蛋白对m6A-RNA的翻译促进功能，阐释了O-GlcNAc修饰可逆调控YTHDF1/3蛋白的新机制，发现了YTHDF糖基化修饰调节相分离性质的规律，为YTHDF家族蛋白的功能提供了更为完善的新机制。最后，YTHDF1/3的可逆糖基化调控机制将营养感知的糖基化修饰和m6A-mRNA的翻译和胞内相分离直接联系在了一起。这一机制将在外界营养条件发生显著变化的生理和病理过程中（例如糖尿病过程）调控细胞的代谢和命运，因此具有重要的生物学意义。

    据悉，浙江大学林世贤课题组的博士后陈宇霖、博士生万芮希及芝加哥大学何川课题组的博士生邹钟毓为本文的共同第一作者。林世贤研究员、何川教授和葛韵研究员为本研究的通讯作者。

    原文链接：https://www.nature.com/articles/s41556-023-01258-X 

    英文摘要：N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant internal mRNA nucleotide modification in mammals, regulating critical aspects of cell physiology and differentiation. The YTHDF proteins are the primary readers of m6A modifications and exert physiological functions of m6A in the cytosol. Elucidating the regulatory mechanisms of YTHDF proteins is critical to understanding m6A biology. Here we report a mechanism that protein post-translational modifications control the biological functions of the YTHDF proteins. We find that YTHDF1 and YTHDF3, but not YTHDF2, carry high levels of nutrient-sensing O-GlcNAc modifications. O-GlcNAcylation attenuates the translation-promoting function of YTHDF1 and YTHDF3 by blocking their interactions with proteins associated with mRNA translation. We further demonstrate that O-GlcNAc modifications on YTHDF1 and YTHDF3 regulate the assembly, stability and disassembly of stress granules to enable better recovery from stress. Therefore, our results discover an important regulatory pathway of YTHDF functions, adding an additional layer of complexity to the post-transcriptional regulation function of mRNA m6A.

    Nature Cell Biology邀请西南医学中心的Jennifer J. Kohler教授为该论文撰写News & Views——O-GlcNAc regulates YTHDF1 and YTHDF3 activity，并与研究论文同时上线。

    News & Views： https://www.nature.com/articles/s41556-023-01275-w 

参考文献：

1. Wang, X. et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature 505, 117-120 (2014).

2. Wang, X. et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell 161, 1388-1399 (2015).

3. Shi, H. et al. YTHDF3 facilitates translation and decay of N(6)-methyladenosine-modified RNA. Cell Res 27, 315-328 (2017).

4. Shi, H., Wei, J. & He, C. Where, When, and How: Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasers. Mol Cell 74, 640-650 (2019).

5. Zou, Z., Sepich-Poore, C., Zhou, X., Wei, J. & He, C. The mechanism underlying redundant functions of the YTHDF proteins. Genome Biol 24, 17 (2023).

6. Zaccara, S. & Jaffrey, S.R. A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating m(6)A-Modified mRNA. Cell 181, 1582-1595 e1518 (2020).