密码子优化是一种通过增加靶基因的翻译效率来提高生物体内蛋白质表达水平的新技术。通常会通过避免稀有密码子，利用偏爱密码子（Preferred codons)、简化mRNA的二级结构、优化重复序列、消除限制酶切位点、调整GC含量等方法重新设计基因，以提高翻译效率，进而提高蛋白表达水平。

基因序列分析工具箱：http://www.detaibio.com/sms2/index.html 

载体家工具栏：

序列比对

序列点阵图

shRNA靶点设计：https://www.vectorbuilder.cn/tool/shrna-target-design.html 

密码子优化：https://www.vectorbuilder.cn/tool/codon-optimization.html 

GC含量计算

DNA二级结构

DNA反向互补

DNA翻译：https://www.vectorbuilder.cn/tool/dna-translation.html   

在线工具：https://www.novopro.cn/tools/ 

 ExpOptimizer密码子优化工具：https://www.novopro.cn/tools/codon-optimization.html    

优化参数（部分）：密码子使用偏好性、5' 区域优化（翻译起始效率）、DNA 重复序列、mRNA 二级结构、GC 含量、SD 序列、排除指定的限制性内切酶位点等。

密码子适应指数（CAI）是指编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的相符程度，取值在0~1之间。CAI可以用来评估外源基因在宿主内的表达水平，CAI越高，则外源基因在宿主内的表达水平越高。

CAI计算工具： http://www.merrybio.com.cn/tools/codon-adaptation-index-calculator.html 

密码子使用频率表：http://www.merrybio.com.cn/tools/codon-usage-table.html 

OPTIMIZER is an on-line PHP application that optimizes the codon usage of a DNA sequence to increase its expression level. 

OPTIMIZER在线优化网址： http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/ 

https://www.novopro.cn/tools/  在线工具包含：

    多肽性质计算器 密码子优化工具 多肽抗原设计 核酸序列DNA GC含量计算器重复序列查找蛋白质二级结构定义工具查找回文序列蛋白疏水性分析蛋白质消光系数计算器寡核苷酸(引物)计算器简并密码子/简并引物设计(deCoDer-R)简并密码子/简并引物设计(非冗余)(deCoDer-NR)计算简并密码子编码氨基酸蛋白溶剂可及表面积计算器蛋白质信号肽预测蛋白质跨膜区预测蛋白质核定位信号预测蛋白二级结构预测硒代甲硫氨酸替换成甲硫氨酸多肽序列转成SMILES多肽库设计蛋白酶消化工具SMILES转成3D结构模型3D模型分子转成SMILESNCBI BLAST(秒开)3D结构模型在线绘图结合能计算亲和力抗体可变区序列编号抗体可变区FR/CDR标注多序列比对环形DNA比对工具序列文件格式转换蛋白质/多肽等电点计算器蛋白质可溶性预测双序列比对（全局比对）双序列比对（局部比对）蛋白质无序区域预测蛋白质motif分析小分子相似性计算二级结构与序列美化展示

    格式转化工具：反向核酸序列互补转换反向翻译FASTA序列拼接EMBL格式转换为FASTAEMBL翻译后序列提取EMBL序列特征提取DNA序列过滤器蛋白质序列过滤器GenBank转换为FASTAGenBank序列特征提取器GenBank翻译提取器单字母简写转换成三字母氨基酸提取指定位置DNA序列提取指定位置蛋白质序列按密码子拆分DNA序列FASTA拆分三字母氨基酸转换成单字母缩写从窗口提取DNA序列从窗口提取蛋白序列

    序列分析工具： 密码子点阵密码子频率及频次计算工具CpG岛预测计算DNA分子量DNA模式查找DNA碱基统计DNA模糊搜索蛋白质模糊搜索序列相似性计算多条蛋白质序列反向翻译DNA序列突变成内切酶位点开放阅读框ORF查找成对排列密码子成对排列DNA成对排列蛋白质PCR引物性质计算根据引物模拟PCR产物蛋白平均疏水性计算蛋白分子量计算蛋白质模式搜索蛋白氨基酸统计汇总虚拟限制性内切酶酶切酶切位点汇总DNA序列翻译成氨基酸序列

    图谱处理工具：保守区比对上色残基性质比对上色格式化输出DNA格式化输出蛋白质引物图谱限制内切酶图谱翻译图谱

    随机序列工具： DNA突变蛋白质突变随机生成编码DNA工具随机DNA序列生成工具DNA区域随机替换工具随机蛋白序列生成工具蛋白区域随机替换工具蛋白质样品DNA样品打乱DNA打乱蛋白质

其他： IUPAC代码遗传代码蛋白质二级结构定义

金斯瑞密码子优化：https://www.genscript.com.cn/codon-opt.html 

功能蛋白的外源宿主表达是现代生物技术的基础，然而很多蛋白由于可能包含有抑制表达的因子：如有机体使用了不常用的密码子等，在外源宿主中很难表达。日益发展的基因设计与合成技术使通过基因设计改善蛋白表达成为可能，例如，可以通过基因设计使基因与宿主的密码子使用频率相匹配来提高蛋白表达水平。金斯瑞基因设计不仅包括密码子优化，还包括mRNA结构修正、翻译起始位点的优化等。

    密码子偏爱与蛋白表达：密码子偏爱性在原核基因表达中已经被证实是一个很重要的影响因素，它引起了同一密码子在不同生物体之间，蛋白的表达水平之间以及同一操纵子的不同部位间利用率的改变。引起这种偏爱性差异的主要原因是不同细胞内可用的tRNAs量的差异。因此优化翻译系统较好的方法就是保持密码子的使用频率与同源tRNA之间的平衡。如在大肠杆菌中，AGG和AGA所对应的tRNA分子就很少，这种差异很明显会影响基因的表达。

  E Y D H   E Y D H   E Y D H   E Y D H    

TTT 0.58 0.59 0.37 0.45 TCT 0.17 0.26 0.08 0.18 TAT 0.59 0.56 0.37 0.43 TGT 0.46 0.63 0.29 0.35   E: E.coli

TTC 0.42 0.41 0.63 0.55 TCC 0.15 0.16 0.24 0.25 TAC 0.41 0.44 0.63 0.57 TGC 0.54 0.37 0.71 0.55   Y: Yeast

TTA 0.14 0.28 0.05 0.07 TCA 0.14 0.21 0.09 0.15 TAA 0.61 0.48 0.42 0.28 TGA 0.30 0.29 0.26 0.52   D: Drosophila

TTG 0.13 0.29 0.18 0.13 TCG 0.14 0.16 0.20 0.06 TAG 0.09 0.24 0.32 0.20 TGG 1.00 1.00 1.00 1.00   H:Human

    将低利用率的密码子替换成宿主常用密码子：通常基因中包含的密码子在特定宿主中的利用率越低，该种蛋白的表达量也就越少，甚至当这种密码子存在与蛋白簇间或者N末端的时候表达量会更少。在不改变氨基酸序列的前提下将低利用率的密码子替换为宿主常用密码子能提高功能蛋白的表达水平。

    去除问题密码子： 任何来源的密码子如果在宿主生物体内的利用率低于5%到10%时, 就会出现表达抑制，当这些低利用率密码子临近或相连时, 对蛋白表达的影响更大。去除低利用率的密码子或者容易被误读为终止信号的密码子能够防止低表达或者不表达。

    哺乳动物细胞表达病毒蛋白：病毒基因经过合适的处理也能在哺乳动物细胞成功表达，病毒基因密集的信息常常引起阅读框重叠，许多病毒基因能够逆序编码。病毒基因不仅表达目的蛋白也表达调控元件，因此能够平均提高蛋白表达量达28%。通过对病毒密码子进行优化以增加靶点免疫原性对于DNA疫苗的研究非常重要。

    其他影响因素： 虽然密码子偏爱在基因表达中起着重要的作用，但表达载体和转录启动子的选择同样重要，N端核苷酸序列的蛋白表达对于低利用率密码子和接近起始位点的密码子AUG非常敏感。翻译与mRNA的稳定性间也存在着相互的影响，虽然降低翻译效率会使mRNA由于缺少了核糖体的保护而更容易被endo-RNAses分解，但目前还没有它们之间影响的完整解释。稳定mRNA二级结构和接近5'端的分子也对基因表达有重要的影响。利用翻译时目的基因上游的开放式阅读框能够成功提高难度基因的表达效率。

其他分子生物学工具网站：

Thermo GeneArt在线工具geneoptimizer：

https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html 

BLOCK-iT™ RNAi Designer

siRNA设计网站/shRNA在线设计：https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do

基因启动子序列查询网站：https://epd.epfl.ch//index.php