端粒长度缩短与心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡的关系

Maren Weischer, Stig E. Bojesen,Richard M. Cawthon, Jacob J. Freiberg,

Anne Tybjærg-Hansen, Børge G.Nordestgaard

目的：检验端粒长度缩短是否增加心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡的风险。

方法与结果：针对2项前瞻性研究（哥本哈根城市心脏研究和哥本哈根普通人群研究）的19383例丹麦普通人群受试者进行端粒长度检测。对受试者19年随访期间共发生心肌梗死929例，缺血性心脏病2038例，死亡4342例。随访完成率100%。2项研究中男性和女性的端粒长度降低均与年龄增加呈线性相关（P=7×10^-74至P=3×10^-125）。端粒长度每缩短1000个碱基对发生心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡的多因素调整风险比（multifactorially adjusted hazard ratios）分别为1.10[95%置信区间（CI）1.01–1.19]、1.06（1.00–1.11）和1.09（1.05–1.13），端粒长度最短十分位与最长十分位相比，心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡的多因素调整风险比分别为1.49（1.07-1.46）、1.24（1.01–1.53）和1.25（1.07–1.46）。

结论：端粒长度缩短仅与心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡风险轻度升高相关。

关键词：急性冠脉综合征；缺血性心脏病；死亡；心肌梗死；端粒长度

Weischer M, Bojesen SE, Cawthon RM,Freiberg JJ, Tybjærg-Hansen A, Nordestgaard BG. Short Telomere Length, MyocardialInfarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arterioscler Thromb VascBiol.. 2012;32:822–9

端粒是染色体线性末端的保护帽，有数量不一的TTAGGG重复序列组成^[1]。在多数细胞中，端粒随每个细胞周期而缩短，故可在细胞水平反应机体的衰老程度^[1，2]。端粒长度随年龄增长而相应缩短^[3，4]，同时也与男性、吸烟、肥胖、氧化应激、紫外线照射和低社会经济水平有关^{[2，3，5-7]}。而端粒长度缩短与心血管病和过早死亡风险的关系尚未形成定论^[5，8-10]。

此前关于端粒长度与人类疾病的研究多受低通量检测技术的限制^[11]，而近期研究多为小样本的病例对照研究，而非针对普通人群无选择性的大型前瞻性研究^[12]。因此，有必要针对大量普通人群开展长期随访，同时采用可靠的高通量检测方法检验端粒长度缩短对心血管病和过早死亡的影响。

本项研究即检验端粒长度缩短是否增加心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡的风险。因此，我们开发了高通量的实时多聚酶链式反应（PCR）校正测定端粒的绝对长度，对来自2项前瞻性研究[哥本哈根城市心脏研究（CopenhagenCity Heart Study）和哥本哈根普通人群研究（Copenhagen General Population Study）]的19383例丹麦普通人群受试者进行检测，并随访19年。

方法

研究设计

哥本哈根城市心脏研究始于1976-1978年，为一项基于人群的前瞻性研究^[13，14]。在1981-1983年、1991-1994年和2001-2003年，从中央人口登记（CentralPopulation Register）中随机选择受试者（年龄≥20岁），并对较年轻受试者进行复检。后2次的全血样本检测均经过DNA分离，纳入的DNA样本来自9765例受试者。

哥本哈根普通人群研究始于2003年（目前仍在招募中），为一项基于人群的前瞻性平行研究^[15]。受试者选择和资料采集均与前者类似，共纳入10073例受试者的DNA样本。

2项研究的所有受试者均为丹麦血统的白人，受试者在2项研究中无重叠，可确保各项研究结果得以独立验证。

协变量

受试者在当天检测前填写自评问卷（涉及目前和既往的生活习惯和健康状态），之后进行体格检查、血样采集和心血管因素评定。研究获取和检测的协变量如下^[13-15]：年龄（岁）、性别（男/女）、总胆固醇水平（mmol/L）、甘油三酯（mmol/L）、高密度脂蛋白胆固醇水平（mmol/L）、高敏C-反应蛋白水平（mg/L）、服用降脂药（是/否）、体重指数（kg/m²）、高血压（是/否，若>140/90mmHg或自报服用降压药为是）、糖尿病（是/否，若非空腹血糖>11mmol/L、自报糖尿病或服用降糖药为是）、目前吸烟（是/否）、大量饮酒（是/否，若女性自报每周饮酒>87.5g，男性自报每周饮酒>175g为是）、缺乏体育锻炼（是/否，若自报休闲时间体育活动每周<4h为是），绝经（是/否，若女性自报已绝经、应用激素替代疗法或年龄≥60岁为是）、应用激素替代疗法（是/否，自报）。

终点指标

通过使用丹麦个人唯一的身份号码，从丹麦公民登记系统（DanishCivil Registration System）中获取死亡日期，从丹麦患者登记（DanishPatient Registry）和丹麦死因登记（Danish Cause ofDeath Registry）中获取心肌梗死和缺血性心脏病的诊断和诊断日期。诊断分类依照WHO国际疾病分类（ICD-8）编号410（心肌梗死）、编号410-414（缺血性心脏病）使用至1993年，之后依照ICD-10编号I21-I22（心肌梗死）、编号I20-I25（缺血性心脏病）。随访均100%完成，故未出现失访现象。

端粒长度

研究选取外周血白细胞进行DNA端粒长度检测，该检测结果与来自其他组织的细胞端粒长度高度相关^[8-10]。采用CFX384实时PCR检测系统（Bio-RadLaboratories，丹麦）和单色多重定量PCR法检测端粒长度^[16，17]。失效样本进行二次检测，再失效再检测，故端粒长度有效检测率>99.9%。NTERA-2内参细胞的批间检测变异系数为2%（按端粒分析Ct值平均17.9个循环计算）和9%（按端粒绝对长度平均2534个碱基对计算）。完整检测方法详见补充信息。

统计分析

采用统计软件包STATA 11.1（StataCorp，CollegeStation，TX）进行分析。双侧P<0.05为有统计学意义。采用Cox比例风险回归模型的左截尾年龄（left-truncatedage）作为时间尺度计算风险比，即对年龄自动进行调整（本文所指调整年龄均采用此自动调整年龄）。自血样采集之日起开始随访观察所有终点指标，受试者在研究入组前符合终点指标的诊断不纳入分析，故各次符合终点指标的受试者人数有所变化。针对所有终点指标，如受试者出现首次终点事件、死亡、迁移或受试至2010年8月17日，符合任一条件者，随访即告终止。哥本哈根城市心脏研究和哥本哈根普通人口研究的最长随访期和中位随访期分别为19年、17年和7年、6年。采用Cox回归调整年龄、性别和所属研究，或多因素调整年龄、性别、所属研究，和总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、C-反应蛋白水平，及服用降脂药、体重指数、高血压、糖尿病、目前吸烟、大量饮酒、缺乏体育锻炼、绝经（仅女性）及应用激素替代疗法（仅女性）等数据。协变量信息完成率>99%，连续协变量资料缺失者基于年龄和性别进行补录，分类数值缺失者归为缺失类别。哥本哈根城市心脏研究中，对1991-1994年和2001-2003年的检测数据经多因素调整后作为时间依赖性协变量。比例风险假设通过-ln（-ln（生存））对ln（年龄）绘图进行目测评定后，未见显著的异常。趋势检验中，按受试者端粒长度分别划分为四分位和十分位，第一四分位和第一十分位为具有最长端粒的受试者。在检验端粒长度与各调整协变量的相互作用模型时，纳入2因素相互作用项目并采用Wald检验判定统计学意义。

伦理事项

丹麦公民数据保护局、Herlev医院、哥本哈根大学医院及当地伦理委员会均批准本研究（KF100.2039/91和H-KF01-144/01）。所有受试者均签署知情同意书。

结果

端粒长度与年龄

2项研究中男性和女性的端粒长度缩短均与年龄增加呈线性相关（P=7×10^-74至P=3×10^-125）（表1）；年龄与端粒长度之间R²值在6%-11%之间波动。在哥本哈根心脏研究和哥本哈根普通人群研究中，每年端粒长度分别缩短20个碱基对和14.5个碱基对。另外，如图1所示，端粒长度缩短还与以下因素相关：男性，总胆固醇、甘油三酯、C-反应蛋白水平升高、高密度脂蛋白胆固醇水平降低、服用降脂药、体重指数增加、高血压、糖尿病、目前吸烟、重度饮酒、缺乏体育锻炼、绝经状态（仅女性）及应用激素替代疗法（仅女性）。

端粒长度与心肌梗死

随访期间，2项研究共有929例受试者发生心肌梗死。端粒长度每缩短1000个碱基对发生心肌梗死的多因素调整风险比为1.10（95%CI 1.01-1.19）（表2）。类似的风险比见于年龄调整、性别调整和所属研究调整模型，也分别见于此2项研究和两个性别。若采用Bonferroni校正，按年龄、性别、生化和生活方式（心血管危险因素）进行亚组分层，则未能证实上述因素与端粒长度缩短的相互作用而影响发生心肌梗死的风险（图2；要求P<0.05/15=0.003）。若将2项研究数据合并，并将端粒长度特异性分为四分位和十分位，则最短分位与最长分位相比，心肌梗死的多因素调整风险比分别为1.18（0.97–1.43）和1.49（1.07-1.46）（四分位和十分位趋势检验P=0.01、P=0.002；图3）。

端粒长度与缺血性心脏病

随访期间，2项研究共有2038例受试者发生缺血性心脏病。端粒长度每缩短1000个碱基对发生缺血性心脏病的多因素调整风险比为1.06（95%CI 1.01-1.11）（表2）。类似的风险比见于年龄调整、性别调整和所属研究调整模型，也分别见于此2项研究和两个性别。若采用Bonferroni校正，按年龄、性别、生化和生活方式（心血管危险因素）进行亚组分层，则未能证实上述因素与端粒长度缩短的相互作用而影响发生缺血性心脏病的风险（图2）。若将2项研究数据合并，并将端粒长度分为四分位和十分位，则最短分位与最长分位相比，缺血性心脏病的多因素调整风险比分别为1.06（0.93–1.20）和1.24（1.01-1.53）（四分位和十分位趋势检验P=0.22、P=0.03；图3）。

端粒长度与过早死亡

随访期间，2项研究共有4342例受试者死亡。端粒长度每缩短1000个碱基对发生过早死亡的多因素调整风险比为1.09（95%CI 1.05-1.13）（表2）。类似的风险比见于年龄调整、性别调整和所属研究调整模型，也分别见于此2项研究和两个性别。若采用Bonferroni校正，按年龄、性别、生化和生活方式（心血管危险因素）进行亚组分层，则未能证实上述因素与端粒长度缩短的相互作用而影响发生过早死亡的风险（图2）。若将2项研究数据合并，并将端粒长度分为四分位和十分位，则最短分位与最长分位相比，过早死亡的多因素调整风险比分别为1.18（1.08–1.29）和1.25（1.07-1.46）（四分位和十分位趋势检验P=4×10^-4

讨论

通过对19383例丹麦普通人群受试者应用高通量的实时多聚酶链式反应（PCR）测定端粒的绝对长度，并随访19年，我们发现端粒长度缩短仅与心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡风险轻度升高相关。尚无法排除有关轻度升高的估计可能与未发现的剩余混杂因素有关。

本研究结果的深层机制可能源自端粒长度缩短是系统退行性表型的标志物，即由于多年心血管因素暴露致细胞损伤，导致组织有丝分裂频率增加从而引发端粒长度缩短^[18]。而系统退行性表型则增加心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡的风险。

前期研究中，我们已证实端粒长度缩短与增龄呈强烈线性相关^{[4，7，19-25]}，同时显示所采用的高通量检测方法是有效的。本研究发现，普通人群每年端粒长度缩短14.5-20个碱基对。这与此前报道的端粒长度每年缩短14-29个碱基相类似^{[3，20，23，26，27]}，而少于某些报道的端粒长度每年缩短>75碱基对^[22-24，28]。这些差异可反映不同国家间人群的变异^[29]，或由批间检测变异所造成（源于早前某些检测结果纳入了亚端粒区）^[30]。

本研究所见端粒长度缩短与心肌梗死风险增加的相关性与此前报道一致^{[4，20，27，31]}，但相关性程度均小于本研究。通过对19284例个体19年随访，共发现929例心肌梗死；端粒最短四分位与最长四分位相比，心肌梗死的风险比为1.18（95%CI 0.97–1.43）。在Bruneck研究（BruneckStudy，800例个体随访10年的前瞻性研究，共发现43例心肌梗死），端粒长度最短三分位与最长三分位相比，心肌梗死的风险比为3.58（1.32–9.70）^[4]。在心血管健康研究（CardiovascularHealth Study，388例个体随访7年的前瞻性研究，共报告36例心肌梗死），端粒长度每缩短1000个碱基对发生心肌梗死的风险比为1.55（0.85-2.83）^[27]，而本研究对应的风险比为1.10（1.01-1.19）。最后，Leicester的病例对照研究（203例患者和180例对照者）报告，端粒长度最短四分位与最长四分位相比，心肌梗死的比值比（OR）为2.79（1.53-5.11）^[20]。总之，先前研究和本研究均支持端粒长度缩短与心肌梗死风险增加的相关性，但本研究若按最大统计效力计算，提示其对心肌梗死风险的估计较之先前研究仅属轻度相关。

本研究中共发现2038例缺血性心脏病，端粒长度最短四分位与最长四分位相比，缺血性心脏病的风险比为1.06（0.93-1.20），较之先前研究仍属轻度相关^[32]。如西苏格兰一级预防研究（West of Scotland PrimaryPrevention Study，484例患者和1058例对照者的巢式病例对照研究），端粒长度最短三分位与最长三分位相比，缺血性心脏病的风险比为1.44（1.10-1.90）^[32]；但由于受试者随机分为他汀组和安慰剂组，故该研究结果无法与本研究直接比较。

本研究共发现4342例过早死亡，端粒长度每缩短1000个碱基对发生过早死亡的风险比为1.09（1.05-1.13），类似于与心血管健康研究（419例个体随访7年的前瞻性研究，共报告36例过早死亡）对应的风险比1.22（0.91-1.63）^[27]。而在一项针对143例≥60岁个体最长随访20年的前瞻性研究中，共报告101例死亡，端粒长度最短半数与最长半数相比，死亡率增加1.86（1.22-2.83）倍^[33]。对比本研究及上述研究中的相关内容^[27，33]，一项针对812例≥73岁个体的前瞻性研究中共发现412例死亡，但端粒长度与总体死亡之间并无相关性^[34]。总之，汇总数据提示，端粒长度缩短与过早死亡风险增加呈轻度相关。

本研究的优势首先在于针对19838例普通人群受试者进行了长达19年的前瞻性随访。其次，采用新型高通量检测方法证实端粒长度与年龄呈负相关。第三，经过多轮随访，受试者端粒长度检测率≥99.9%。第四，借助于丹麦公民登记系统和丹麦患者登记系统，本研究随访期间获取了有关心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡的完整信息。第五，本项研究通过应用2项独立研究的数据以获取结果。第六，本研究将端粒绝对长度校正为5290个碱基对，与先前报道的该细胞系5360个碱基对和6500个碱基对具有可比性。

本研究的局限在于仅针对白人观察心血管病和过早死亡风险，所以本研究结果未必适用于其他种族人群。其次，本研究测定端粒长度仅限于外周血白细胞，尽管白细胞端粒长度与来自其他组织的细胞端粒长度高度相关^[5，8-10]，但未能检测覆盖人体其他细胞类型。最后，诸如端粒长度等与年龄高度相关的变量，是否可作为疾病发病率和死亡率等变量的非年龄依赖性决定因素，此问题仍然悬而未决。虽然端粒长度缩短与增龄相关，但年龄只能解释端粒长度6%-11%的变异，故本研究在统计分析时对年龄进行了调整。

综上所述，端粒长度缩短仅与心肌梗死、缺血性心脏病和过早死亡风险轻度升高相关。

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