氢气生物学研究首先是生物学研究，和其他生物学研究的手段没有区别，氢气生物学本身区别于其他研究的关键内容是氢气浓度的检测，因为氢气的浓度检测对分析氢气在体内运行规律，氢气在身体内的分布特点以及氢气的剂量效应关系等都是十分必要的研究内容。用于检测氢气的手段有许多，其中最经典的是气相色谱检测技术，最方便的是氢气电极检测技术，而最简单的是氧化滴定技术。

气相色谱技术可以定量分析微量甚至痕量的氢气。氢气电极检测技术可以测量的范围非常大，即可以检测微量的氢气，例如组织中的氢气，也可以检测溶液中浓度比较高的氢气，更重要的是这种方法可以进行连续在体检测，对研究氢气的剂量效应具有其他方法无法取代的地位。氧化滴定技术本身的敏感性和选择性都比较差，而且受到检测样本的氧气或各类氧化还原性物质的影响，更多地用于氢气水产品的定性鉴定。另外，采用质谱法可以检测极低浓度的氢气，一般情况下氢气生物学效应研究中很少采用。

本章对这些技术进行简单介绍，关于具体的操作需要根据具体试验要求，结合特殊的仪器操作程序进行检测。

第一  气相色谱法

气相色谱法测定氢气的浓度在氢气生物学研究中广泛采用，可以对氢气溶液中氢气或血液中氢气的浓度进行检测，例如2007年的第一篇氢气生物学论文都曾经采用这种方法，最近有学者用这种方法检测了人呼吸氢气后血液中氢气的浓度变化规律（图8.1）。

图8.1. 人呼吸1-4%氢气前后血液氢气浓度（mM）的变化。（图片来自Ono et al. Med Gas Res. 2012;2:22）

气相色谱法是用气体作为移动相的色谱法。常用来分析高纯气体中的杂质及工业生产中的低浓度气体。根据所用固定相的不同可分为两类：固定相是固体的，称为气固色谱法；固定相是液体的则称为气液色谱法。按色谱分离原理来分，气相色谱法亦可分为吸附色谱和分配色谱两类，在气固色谱中，固定相为吸附剂，气固色谱属于吸附色谱，气液色谱属于分配色谱。

按色谱操作形式来分，气相色谱属于柱色谱，根据所使用的色谱柱粗细不同，可分为一般填充柱和毛细管柱两类。一般填充柱是将固定相装在一根玻璃或金属的管中，管内径为2-6毫米。毛细管柱则又可分为空心毛细管柱和填充毛细管柱两种。空心毛细管柱是将固定液直接涂在内径只有0.1-0.5毫米的玻璃或金属毛细管的内壁上，填充毛细管柱是近几年才发展起来的，它是将某些多孔性固体颗粒装入厚壁玻管中，然后加热拉制成毛细管，一般内径为0.25-0.5毫米。在实际工作中，气相色谱法是以气液色谱为主。

气相色谱技术所用的仪器为气相色谱仪。除另有规定外，载气为氮气。色谱柱为填充柱或毛细管柱，填充柱的材质为不锈钢或玻璃，载体用直径为0.25～0.18、0.18-0.15或0.15-0.125毫米经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球。常用玻璃或弹性石英毛细管柱的内径为0.20或0.32毫米。进样口温度应高于柱温30-50℃，进样量一般不超过数微升，柱径越细进样量应越少。

气相色谱系统由盛在管柱内的吸附剂或惰性固体上涂着液体的固定相和不  气相色谱法断通过管柱的气体的流动相组成。将欲分离、分析的样品从管柱一端加入后，由于固定相对样品中各组分吸附或溶解能力不同，即各组分在固定相和流动相之间的分配系数有差别，当组分在两相中反复多次进行分配并随移动相向前移动时，各组分沿管柱运动的速度就不同，分配系数小的组分被固定相滞留的时间短，能较快地从色谱柱末端流出。以各组分从柱末端流出的浓度 c对进样后的时间t作图，得到的图称为色谱图。从色谱图可分析各组分在进样后至其最大浓度流出色谱柱时所需的保留时间，与组分通过色谱柱空间的时间，及组分在柱中被滞留的调整保留时间的关系。

从柱后流出的色谱峰不是矩形，而是一条近似高斯分布的曲线，这是由于组分在色谱柱中移动时，存在着涡流扩散、纵向扩散和传质阻力等因素，因而造成区域扩张。在色谱柱内固定相有两种存放方式，一种是柱内盛放颗粒状吸附剂，或盛放涂敷有固定液的惰性固体颗粒；另一种是把固定液涂敷或化学交联于毛细管柱的内壁。用前一种方法制备的色谱柱称为填充色谱柱，后一种方法制备的色谱柱称为毛细管色谱柱。

经过分离的样品中目标组分检测到色谱峰信号进行积分，根据和标准品进行比对和计算出相应成分的浓度。氢气分子生物学除呼吸气氢气浓度检测外，一般都是对溶液或生物样品中的氢气浓度进行检测。气相色谱技术在本质上是属于组分分离技术，对氢气的检测，可以采用顶空瓶加热释放的方法将氢气从溶液中释放出来进行检测。而不同的检测方法，对氢气的浓度分辨率存在巨大的差别。例如采用普通的热导检测技术，只能检测到数个ppm的浓度，这显然无法检测只有0.01 ppm以上生物样品中的氢气浓度。检测生物样品中氢气的浓度，例如血液中氢气的浓度，一般都是10 ppb以上浓度，其检测难度则比较大。

Takao等将气相色谱分离技术与原子吸收光谱的高灵敏度性能结合起来,制作了氢气分析仪。他们将氖气作为载气，经过净化器除去杂质气体后与样品气体在控制阀箱内形成混合气体，然后进入分离柱，分离柱处在充满液氮(温度为零下196℃) 的密闭容器中，样品气体中含有的一氧化碳、氧气等气体由于沸点高于零下196℃而被从混合气体中分离出来，经除杂后的氢气被送入原子吸收痕量还原检测器( TRD)，在此氢气还原氧化汞发生化学反应，产生水和汞蒸气。通过原子吸收方法检测汞蒸气就可以得到相应的氢气含量。应用该方法可检测到的氢气最低体积分数为5 ppb。该方法是一种非常灵敏的氢气检测技术，巧妙地应用氧化汞与氢的化学反应，对产生的汞蒸气进行原子吸收光谱法检测。但是该方法分离杂质所要求的极低温度却不易获得，目前只限于实验室研究，难以满足普通现场氢气检测的要求。