回答一个科学问题需要证据，生物医学研究由于存在许多干扰因素，必须有多方面的证据，一个比较成熟的实验室出来的论文，水平往往比较高，论证一个问题的逻辑性比较强，而档次比较低的研究，作者往往在平行证据上浪费功夫，结果是出力不讨好。

最近看一些文献和审阅稿件的过程中，发现一个现象：相对比较好的工作和比较差的工作明显主要是在设计上存在很大的差别。平庸的学者往往存在鲁莽的行为，容易大量重复不能说明问题的实验，而聪明的学者则会在设计上下足功夫。极端情况下，个别有致命的错误研究也会因为设计上的漂亮进入高档次杂志。

看到一个来自韩国学者的稿件，他们希望证明两个天然化合物是否具有抗过敏的作用，首先选择一个细胞，把药物和阳性对照药物加到这个细胞中，观察是否影响这种细胞内活性氧降低，因为降低活性氧往往是许多抗过敏药物的共同特点，结果发现确实有这种作用，但作用不如阳性对照药物。随后他们用细胞脱颗粒作为细胞激活的指标，又发现这种药物具有作用，当仍不如阳性对照药物。随后他们验证这种药物是否对影响这种细胞的几种细胞内信号，特别MAPK的三种分子的磷酸化是否有影响，结果仍发现有影响，可以减少这些分子的磷酸化水平，随后他们用PCR检测药物对这个细胞的几种重要细胞因子基因表达的影响，结果同样，有作用，但比阳性对照药物差很多。最后作者的结论是，这药物有抗过敏的作用，但比过去发现的类似药物效果差。工作量不小，但意义何在？而且每种检测指标都选择3种不同药物剂量，初步计算下来这个工作耗费的经费不少，好在这个实验室获得的经费不少，但也没有必要如此浪费经费去做没有什么价值的工作。因为这些证据根本不能回答任何有价值的问题，一是效果不理想，研究意义不大，另外这些药物是否有动物或人体的依据也不清楚，做过敏用细胞学研究似乎也距离实际情况很远。关于信号分子，也有可能只是一种伴随现象，几乎所有的分子都呈现类似的变化规律，但没有任何特意性，提示可能只是一种伴随现象而已。相信我们周围的许多学者都做类似的研究工作。

昨天阅读一PANS上的论文，是证明一氧化氮可以影响神经兴奋毒性，研究分三个阶段。第一步是证明一氧化氮可以引起一种信号分子蛋白Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase-2(SHP-2)发生S-nitrosylated。第二步，证明SHP-2发生S-nitrosylated会导致这个分子的功能下降。第三步，是证明SHP-2下游分子erk的磷酸化的保护作用。

第一步证明一氧化氮可以引起一种信号分子蛋白SHP-2发生S-nitrosylated。（1）用 SHP-2分子和NO分子供体混合，2,3-diaminonaphthalene化学分析证明一氧化氮可直接导致SHP-2分子S-nitrosylated。（2）如果将SHP-2分子的活性氨基酸半胱氨酸去掉，则这种S-nitrosylated就不会发生，这说明这种S-nitrosylated发生在SHP-2分子的活性氨基酸半胱氨酸部位Cys-459。（3）用生物素转换分析技术，证明HEK293细胞的裂解液和活的HEK293细胞都可以发生SHP-2分子S-nitrosylated（生物素转换方法(biotin switch assay),一种设计用来检测蛋白质巯基亚硝基化的方法）。将细胞的裂解液和NO分子供体Snitrosoglutathione,混合，可以促进SHP-2分子S-nitrosylated。(4)为证明内源性NO也可以产生同样作用，使用可稳定表达nNOS的 HEK293，用生物素转换方法证明用钙离子载体A23187将nNOS激活后，结果发现SHP-2分子S-nitrosylated增加2.5倍，使用nNOS阻断剂NNA可以阻断这种效应。而用过氧化氢不可以产生SHP-2分子S-nitrosylated。（5）为证明这种现象在动物体内仍会发生，用脑缺血模型，也用生物素转换方法证明缺血后大脑皮层也存在SHP-2分子S-nitrosylated（2.5倍）。上述实验证明，在病理情况下，硝基化应激确实可导致SHP-2分子S-nitrosylated。上述研究中，围绕一个分子的S-nitrosylated，从单个蛋白分子，到细胞裂解液体，到细胞最后到动物，可以说把各个状态都做一遍。我们可能觉得，只要可以证明整体动物存在这种现象不就足够了吗？何必兴师动众，做那么全面。其实，这是作者偷懒的表现，我们可以用整体的基因敲除动物来完成部分内容，例如为说明是nNOS来源的一氧化氮，我们可以用药物阻断的方法来证明这个。但是要证明这种S-nitrosylated发生在蛋白的分子部位，则需要体外的实验比较方便。其实同样一个问题，可以采用不同的手段来说明，不一定完全一样。

第二步。是证明SHP-2分子S-nitrosylated可以导致这个分子的活性降低。而该活性的降低可以导致神经兴奋毒性增加（NMDA毒性）。因为这种修饰发生在分子的活性部位，推测会影响起活性，采用SHP-2分子的底物pNPP（p-nitrophenyl phosphate），已经有研究证明野生型SHP-2可以大量磷酸化pNPP，但活性中心破坏的SHP-2分子没有这个能力。NO分子供体SNOC也可以导致SHP-2失去磷酸化pNPP的能力。然后在细胞上证明同样的效应，使用NO分子供体SNOC可以使皮层神经细胞产生SHP-2失活，用A23187将nNOS激活后也可产生类似效果，而NAA可阻断A23187的效应。这些研究说明，细胞内NO释放可以导致SHP-2失活。

到这个阶段，提出这样的问题，作为存活信号的SHP-2失活，会不会导致细胞容易死亡？首先，重复第一步中生物素转换方法，证明NMDA可以通过提高NO释放引起大鼠皮层细胞SHP-2分子S-nitrosylated（2.5倍，有三个都是这个倍数，很诡异）。

由于前人已经证明SHP-2分子失活可以促进脑缺血损伤，这里作者补充高表达SHP-2分子可以保护NMDA引起的神经细胞凋亡，而表达没有活性的SHP-2分子（作者说这类似S-nitrosylated？）没有这样的保护作用。这里还有一个补充，是使用NO阻断剂可以保护NMDA引起非SHP-2分子高表达的神经细胞凋亡（是想说野生细胞有这个功能）。（感觉这个部分的试验有一些唐突。）

为确认SHP-2分子的保护效应，采用小RNA将SHP-2分子表达下调，发现可以促进NMDA引起的神经细胞凋亡。这些研究说明SHP-2分子具有对抗NMDA毒性的作用，但是NMDA引起的NO 可以导致SHP-2分子S-nitrosylated，导致SHP-2对抗NMDA毒性的能力丧失。为确认这个故事，采用western检测S-nitrosylated SHP-2在总SHP-2的比例，结果发现NMDA等手段确实可以促进S-nitrosylated SHP-2的相对数量。

第三步，找到一个下游分子erk来解释SHP-2分子的保护效应。虽然这对整个故事完整性有帮助，但仔细看是最不理想的内容，因为这个部分很有一些贴膏药的嫌疑，就是为通路而通路，首先用erk阻断剂，观察对NMDA引起的神经细胞凋亡具有促进作用（这个应该有人作过），似乎我主题关系不大，就是在证明erk也是保护分子而已。然后继续用erk阻断剂，证明可以翻转因为nNOS阻断引起的保护效应，说是验证了上述通路，最多提示，没有什么确认性的现象，这可以说是因为erk本身的作用，和这个通路无关。然后检测是否SHP-2可以引起erk磷酸化，这个也是应凑的研究，已经早就证明的现象，结果发现NMDA处理可以引起erk磷酸化（注意，这是NMDA引起的存活通路激活），而将SHP-2表达阻断则可以翻转这种影响，提示NMDAerk磷酸化需要SHP-2。按照本研究的主要目的，NMDA处理应该是引起erk磷酸化降低。而NMDA促进erk磷酸化的结果恰好说明这个通路值得怀疑。这又怎么解释？http://www.pnas.org/content/early/2013/01/30/1215501110.long