氢水对小鼠睡眠的作用研究【美国】

博主：人的一生中，约三分之一的时间都在睡眠中度过，充足的睡眠对个体身心健康至关重要。然而调查显示，越来越多的人出现“睡不着，睡不好”的问题，全球超过十分之一以上比例的人长期处于失眠的干扰。失眠也是目前最常见的一种睡眠障碍，药物治疗目前仍然是临床上治疗失眠的主要手段，有效的治疗药物非常多，但没有副作用的有效药物非常少见。因此寻找更安全有效的抗失眠工具成为这一领域的一个诉求。这也是最近美国学者开展氢气促进睡眠研究的重要基础。氢气具有抗炎症抗氧化作用，对人没有任何毒性。如果对人类失眠也能产生类似作用，将对于解决人类失眠问题提供重要的策略。可喜的是，许多人发现，吸入氢气对于改善睡眠的效果不错，希望这不都是安慰剂效应。

Hydrogen-rich water improves sleep consolidation and enhances forebrain neuronal activation in mice | SLEEP Advances | Oxford Academic (oup.com)

原文的研究意义声明：全球超过10%的人口与睡眠不足作斗争，很少有有效的治疗方法没有有害的副作用。本研究提出了富氢水作为治疗睡眠相关疾病的一种安全、可获得的潜在治疗途径。Over 10% of the global population struggles with sleep deprivation and has few effective treatments without harmful side effects. This study presents hydrogen-rich water as a safe and accessible potential therapeutic pathway for the treatment of sleep-related diseases.

富氢水可改善小鼠的睡眠巩固并增强前脑神经元的激活

研究目标

睡眠不足会导致各种健康问题并损害神经功能。氢分子最近作为一种无毒的增效剂和健康促进剂而广受欢迎。氢分子对睡眠和睡眠相关神经系统的影响仍未得到探索。本研究调查了富氢水 （HRW） 对睡眠不足小鼠睡眠行为和神经元激活的影响。

研究方法

成年C57BL/6J小鼠植入脑电图（EEG）和肌电图（EMG）记录电极，并随意给予富氢水（0.7-1.4mM）或普通水7天。在基线条件下和急性睡眠丧失后记录睡眠-觉醒周期。使用 cFos 免疫染色评估睡眠和觉醒相关区域的神经元激活。

研究结果

富氢水增加了未受干扰小鼠的睡眠巩固，并增加了睡眠剥夺小鼠的非快速眼动（NREM）和快速眼动（REM）睡眠量。富氢水还减少了小鼠在光照开始后入睡的平均时间。在所有用富氢水治疗的小鼠中，外侧隔、内侧隔、腹外侧视前区和正中视前区的神经元激活均发生显着改变。

结论

富氢水改善睡眠巩固并增加睡眠相关大脑区域的神经元激活。它可能是一种简单、有效的治疗方法，可以改善睡眠不足后的恢复。

主要参考论文

Vincent S, Madani M, Dikeman D, et al. Hydrogen-rich water improves sleep consolidation and enhances forebrain neuronal activation in mice[J]. Sleep Advances, 2023: zpad057.

论文作者

S Vincent, M Madani, D Dikeman, K Golden, N Crocker, C Jackson, S Wimmer, M Dover, A Tucker, C A Ghiani, C S Colwell, T W LeBaron, A Tarnava, K Paul

论文作者单位

1美国加州大学洛杉矶分校综合生物学和生理学系 2美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院病理学和检验医学系 3美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院精神病学和生物行为科学学系 4美国南犹他大学运动机能学和户外娱乐学系 5.美国分子氢研究所 6加拿大天然健康现在健康产品公司。

一、前言

睡眠不足是现代社会的一个标志。近30%的美国成年人每天平均睡眠时间少于6小时，全球超过10%的人口经历过某种形式的失眠。这个问题广泛存在，对个人健康产生了严重而复杂的后果。急性睡眠损失会导致促炎反应、增加生理压力、损害记忆、降低胰岛素敏感性，并可能加速慢性复杂疾病的进展。慢性睡眠不足与死亡率显著增加有关。睡眠不足在大脑和身体中都有全球和局部的影响，而睡眠紊乱是许多疾病的风险因素和后果之一。当心理健康障碍和失眠并存时，改善睡眠通常足以改善共病症状。改善睡眠的行为干预可以有效，但往往不足以解决常见的睡眠障碍。如果行为干预效果不佳，通常会开具药物催眠剂，因为它们起效快。然而，这些药物常常伴随着不良副作用，长期使用可能导致药物依赖。其他常用于解决睡眠问题的药物是重新使用的“标签外”药物，它们除了影响睡眠外还具有广泛的生物学影响。一种在不产生有害副作用的情况下改善睡眠质量或减少睡眠损失后果的干预措施的价值是不可忽视的。

在过去十年中，氢分子作为一种有广泛潜在益处的有前景的治疗方法引起了关注，例如调节促炎介质和调节胰岛素敏感性。即使在高浓度下也没有报告的细胞毒性，因此普遍认为没有有害副作用。氢气可以通过吸入或溶解在盐水或水中（富氢水）来给药。根据剂量/浓度的不同，口服富氢水可能会增加大脑中的氢气水平。在大鼠中，富氢水剂量依赖性地增加血液中的氢气浓度。重要的是，氢气似乎对人类大脑代谢具有区域特异性影响。在帕金森氏症的大鼠模型中，口服富氢水比吸入氢气更能减轻多巴胺能细胞的损失。最近的人类研究表明，富氢水可能提高警觉性和认知功能，类似于咖啡因的作用，但可能通过不同的机制实现。面对药理学或化学挑战时，富氢水似乎在海马体中起到神经保护作用。虽然许多报告表明富氢水可以有利地调节各种神经生物学过程和行为，但其对睡眠的影响尚不清楚。

在本研究中，我们测试了让野生型C57BL/6J小鼠自由饮用0.7-1.4 mM富氢水7天的能力，是否足以改变其基线睡眠-觉醒结构和对急性睡眠剥夺的反应。我们使用多导睡眠图评估自由活动小鼠的几个电生理学和行为学标记物，以评估昼夜活动和睡眠压力。这是首次进行此类评估富氢水对睡眠和觉醒行为影响的随机对照研究。另外，我们对上述富氢水处理方案后已知与睡眠和觉醒相关的脑区域的神经元激活进行了分组对比评估。

二、实验方法

2.1实验动物

成年C57BL/6J小鼠在加州大学洛杉矶分校（UCLA）在一个由大学动物研究委员会和实验动物医学部控制的研究区域进行12小时12小时光暗循环（LD）。除非另有说明，否则食物和水可随意提供。睡眠剥夺是由专家对实验条件的处理进行的。实验是使用了美国国立卫生研究院的实验室动物护理和使用指南进行的，并得到了机构动物护理和使用委员会的批准。关于动物实验的完整时间轴，见补充图S1和S2。

Figure S1. Visualization of experimental protocol for sleep experiments.

 Figure S2. Visualization of experimental protocol for IHC experiments.

2.2多导睡眠图电极植入

成年C57BL/6J小鼠（出生后第10周；n=10；雄性=6，雌性= 4）小鼠植入脑电图/肌电图头支架进行多导睡眠图（PSG）记录。如前所述，小鼠在麻醉下分别植入4倍脑电图和2倍肌电图电极。两个电极（额顶叶和地面）位于bregma前1.5 mm和中央缝合线（EEG1）两侧1.5 mm。另外两个电极（顶叶-枕叶和普通参考线）位于bregma后2.5 mm和中央缝合线（EE2）两侧1.5 mm。用环氧银实现了螺杆电极和头支架之间的电连续性。使用不锈钢聚四氟乙烯涂层金属丝插入颈部肌肉，监测肌电图EMG活动。头部安装（2×3针网格阵列）用牙科丙烯酸树脂固定在颅骨上。术后7天，将小鼠转移到声音衰减室，并连接到数据采集系统。在记录室中，小鼠在记录前再适应一个安装在笼子上方的低阻力换向器上的轻量级系绳7天。在所有的栓系实验中，小鼠都有自由的活动范围。

2.3富氢水制备

在聚碳酸酯瓶中的590毫升去离子水中加入镁片，生产富氢水。镁原子与水反应生成氢气： Mg +H2O→H2 + Mg（OH）2。瓶子密封，在4摄氏度下过夜，供第二天使用。-2ppm（1.0 mM）氢气浓度和2小时的半衰期通过氢浓度蓝滴定试验得到确认。片剂由富氢水天然保健品（新威斯敏斯特，加拿大不列颠哥伦比亚省）提供。

2.4氢水使用方法

小鼠被随机分配到两组中的一组，以解释意外的顺序效应。第1组连续7天自由获得标准去离子水，随后进行24小时多导睡眠记录，随后通过温和处理剥夺6小时睡眠的时间和18小时恢复睡眠。从第二天开始，小鼠可以自由获得富含氢气的水7天。氢气含量的半衰期被确定为大约2小时，因此在其活性阶段每2小时更换一次水，以在每天的活性阶段保持1.0-2.0ppm的富氢水浓度。小鼠在其不活跃阶段都可以获得最新使用的富氢水。在第7天进行富氢水处理后，立即收集了另外24小时的记录，然后再进行6小时的睡眠剥夺和18小时的恢复。在记录期间，小鼠可以自由获得标准去离子水，而不接受富氢水。组2经历了相反的计划，以解释治疗条件的任何潜在的顺序影响。在接受标准去离子水7天时，两组患者的笼子在活动阶段每2小时被轻轻干扰一次，以控制实验人员反复更换瓶子所造成的任何意外影响。

2.5多导睡眠图数据的采集与处理.

48小时连续多导睡眠图记录，包括24小时基线、6小时睡眠剥夺和18小时恢复，从光照开始、授时因子时间（ZT）0。数据采集是在运行多导睡眠图软件的计算机上（Sirenia）上进行的。信号通过前置放大器进行放大和高通滤波（0.5 Hz）。脑电图信号采用40 Hz的截止频率进行低通滤波，并以400 Hz的采样率连续采集。

采集后，脑电图和肌电图波形按10秒阶段分为：1）觉醒（低压、高频脑电图；高振幅肌电图）；2）非快速眼动睡眠（高压、混频脑电图；低幅度肌电图）；或快速眼动（REM）睡眠（以theta活动为主的低压脑电图（6-10Hz）；极低振幅肌电图）。

所有的睡眠评分都是由对实验条件知情的专家技术人员进行的。被确定有伪影（由抓挠、运动、进食或饮水引起的干扰）被排除在分析之外。人工假象只占所有用于分析的记录的不到5%。 将每个脑电图的NREM特定增量（0.5-4.0Hz）功率分别除以每个脑电图的特定总功率，计算每2小时的NREM相对增量功率。对每个条件都完成了这些计算，下面提供了一个示例公式：

特征提取是使用内部构建的专有MATLAB脚本完成的，目的是从使用上述的Sirenia获取平台获得的数据中自动提取感兴趣的>40睡眠特征。此脚本可根据要求免费使用。

2.6 动物处理和免疫组织荧光分析。

成年C57BL/6J小鼠（出生后12周；n=33；雄性=16，雌性=17）伪随机分为以下一组： (1)未受干扰小鼠自由获得标准去离子水，CON；(2)睡眠剥夺小鼠自由获得标准去离子水，CON+DEP；(3)自由获得富氢水、富氢水；(4)睡眠剥夺小鼠自由获得富氢水、富氢水+DEP。HRW和HRW+DEP小鼠接受了上述7天的自由获取富氢水。CON和CON+DEP小鼠的水瓶紊乱如上所述。

在治疗的第7天，CON组和HRW组从ZT 0-6开始被允许睡眠6小时，而CON+DEP组和HRW+DEP组通过温和的处理被剥夺睡眠6小时。各组均在ZT6条件下灌注（平均= ZT 6.61 ± 0.2）。任何两组间平均灌注时间的差异均不超过7min。用真硫酚（150 mg/kg）安乐死小鼠，1倍PBS灌注10ml，然后4%多聚甲醛（PFA）灌注10ml。取出大脑，用4% PFA在4℃下固定过夜，然后转移到含有15%蔗糖的1xPBS溶液中。固定的大脑保存在15%的蔗糖中，1xPBS + 0.1%叠氮化钠，直到准备切割。

在低温恒温器（徕卡）上获得浮动冠状切片（50 μm），并依次收集到含有1：1冰冷甘油的24孔板中，并在-20ºC下保存。一个人收集了所有4个实验条件下的所有切片和大脑，在任何一个低温恒温器会议期间进行切片，以确保组织收集条件不会不成比例地影响任何一组(s)。切片沿着前后轴配对并染色。首先，切片在室温下封闭1小时（1%牛血清白蛋白），然后在4◦C与兔多克隆抗血清（1：1000，细胞信号），然后是cy3偶联的驴抗兔二抗（1：300）。

切片被安装并覆盖含有DAPI，并在蔡司Axio成像仪M2显微镜上观察，配备了AxioCam MRm和ApoTome成像系统。使用20X物镜和蔡司Zen数字成像软件的Tile工具获得计数图像（每个动物和条件下2-4张）。感兴趣区域（roi）在ImageJ中定义和手动追踪，使用艾伦研究所的小鼠大脑图谱（华盛顿大学）作为参考。借助ImageJ的细胞计数器插件，在至少两个连续的切片中对确定的roi中的c fos阳性细胞进行计数。将每个观察者在2-4个切片中获得的值取平均值，得到每个动物的一个值。

2.6统计学分析.

所有数据均采用GraphPadPrism9.3.1版本进行分析。睡眠结构数据采用配对t检验进行分析。采用双向重复测量方差分析来分析时间和治疗在基线和恢复记录期间对非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠的影响。慢波活动在时间和治疗条件下进行了评估，由于慢波活动仅在非快速眼动睡眠期间进行了评估，并且有一些两小时的时期没有发生非快速眼动睡眠，因此数据使用混合效应模型进行分析。使用Bonferroni的方法对多重比较进行了校正。对于c Fos免疫荧光数据，采用以睡眠条件和治疗为因素的双向方差分析，比较各组间c Fos+细胞总数。两组间的事后比较采用Bonferroni的多重比较检验或本贾米尼和霍赫伯格的方法来控制错误发现率。统计学意义设为p<0.05。确切的p值和相关的统计值在图表中报告。

三、实验结果

3.1富氢水可以缩短小鼠在光照开始后的入睡时间。

在未受干扰的情况下，光照开始后的入睡时间是衡量睡眠效率的指标之一。在12:12小时光暗周期的自由睡眠中，光照开始后的睡眠（在小鼠模型中常被称为“入睡潜伏期”）是衡量睡眠效率的标准和常用的测量方法，也是诊断失眠等睡眠障碍的标准之一。年龄、慢性疼痛的存在与否、酒精使用和运动等因素都会影响入睡时间。在这里，我们测试了富氢水处理足以促进小鼠睡眠的假设。在基线期，入睡时间定义为动物在光照开始后累积至少一次（20秒或更长）非快速眼动睡眠所需的时间。在恢复期的入睡时间是指动物在光照开始后结束睡眠剥夺（ZT 6）后累积至少一次非快速眼动睡眠所需的时间。经过7天的自由饮用富氢水，在活动阶段，配对t检验显示入睡时间（P=0.0313，t=2.549，df=9）在未受干扰的基线条件下存在统计学上的显著差异，富氢水处理使入睡时间缩短了>50%（图1A）。经过6小时的温和处理导致的急性睡眠剥夺后，我们认为入睡时间作为睡眠效率的指标出现了“天花板效应”（即小鼠无法比“立即”更快地入睡），因此观察到富氢水处理对恢复期没有影响（图1B）。

图1氢水对小鼠睡眠的作用。

3.2富氢水处理不会影响正常睡眠量。

小鼠具有多相睡眠 - 尽管它们在无活动（光照）阶段积累了大部分睡眠，但在有活动（黑暗）阶段仍然获得相当数量的睡眠。未受干扰的C57BL/6J小鼠的睡眠结构和对急性完全睡眠剥夺的反应（例如增加非快速眼动睡眠）已有详细记录且非常稳定。在富氢水处理期间，通过双向方差分析发现富氢水对NREM或REM在整个基线记录期间的典型分布没有影响，无论是在睡眠剥夺期间还是在18小时恢复期内（图2A-D，表1）。

3.3富氢水处理增加了睡眠剥夺后的非快速眼动和快速眼动睡眠量。

在成人中，总睡眠对所有原因死亡率有显著影响，并且是评估睡眠障碍的重要临床终点以及几种复杂的慢性疾病的关键因素。美国睡眠医学学会的建议反映了几十年的睡眠研究，并指出每晚少于7小时的睡眠不足以维持健康。在我们对小鼠睡眠的多项睡眠研究中，我们发现富氢水处理对基线条件下的非快速眼动或快速眼动睡眠量没有显著影响（图3A,C）；然而，在基线活动阶段非快速眼动睡眠略有增加（P=0.0524，t=2.233，df=9），接近显著性水平。我们发现富氢水处理与非快速眼动（P=0.0003，t=5.767，df=9）和快速眼动（P=0.0045，t=3.757，df=9）睡眠量的增加有关（图3B,D），尽管睡眠剥夺干预措施相同（图3E）。虽然常用的非快速眼动获得-失去比率没有显著差异（图3F），但这可能是因为该终点对阶段性影响的不敏感性（图3B,D）。富氢水处理增加了未受干扰小鼠的睡眠巩固能力。

图3 氢水显著提高睡眠剥夺后的非快速眼动和快速眼动睡眠量。

频繁的觉醒和慢性的睡眠不良是一些神经退行性疾病和睡眠呼吸暂停的标志。以前的报告表明，显著的睡眠碎片化挑战可以影响过程S和依赖睡眠的生理过程，而不显著改变日常节奏。为了评估碎片化的变化，我们评估了（1）短暂觉醒的次数（持续≤10秒的觉醒期，打断NREM），（2）NREM bouts的数量，以及（3）NREM bouts的持续时间。使用Benjami和Hockberg后测试的配对t检验显示，治疗条件对未受干扰小鼠的短暂觉醒有显著影响（图4A），经过7天的随意饮用富氢水处理，小鼠产生了约30%的短暂觉醒减少。

我们还报告了富氢水处理基线小鼠NREM bouts数量的减少（图4B），以及NREM bouts持续时间的非显著增加（图4C）。这些结果表明，富氢水处理可能与未受干扰小鼠的NREM睡眠巩固改善有关。在恢复睡眠期间，富氢水对睡眠碎片化的测量没有显著影响。重要的是，我们确实观察到了睡眠剥夺对NREM bouts的重要预期影响，睡眠剥夺的小鼠经历更少的NREM bouts（P<0.0001，t=5.968，df=19），并且bouts的平均长度更长（P<0.0443，t=2.154，df=19）。这种已知的睡眠剥夺效应作为一个重要的阳性对照。

图4 氢水饮用与动物短暂觉醒的显著降低有关.

3.4富氢水处理不影响NREM delta特征。

慢波是低频率（delta带，0.5-4.0Hz），高振幅振荡，主导深度NREM睡眠阶段，其功率变化被认为是反映睡眠压力的变化。在我们的研究中使用EEG测量并以总功率的分数表示，慢波活动（SWA）是常用于人类和动物模型中可用EEG的家庭动态指标。在睡眠剥夺后，小鼠在EEG2中表现出预期的NREM相对delta功率（SWA）反弹（图S3），但用于解释多个混合效应分析的Bonferroni后测试未显示出治疗条件之间的显著差异（图5，表2）。富氢水对已知睡眠和觉醒核团中的细胞活性的影响可能是区域特定的，在啮齿动物模型中，最近的人类工作显示，高剂量富氢水可以在某些脑区域的胆碱‐肌酸比水平上增加，从而改变大脑代谢。目前尚不清楚富氢水是通过有意义的增加大脑中的氢气还是通过某种第二信使来影响大脑。在另一项研究中，我们评估了几种已知的睡眠调节前脑结构中立即早期基因cFos表达的变化，共分为4个条件：未受干扰、未处理的小鼠（CON）；睡眠剥夺、未处理的小鼠（CON+DEP）；未受干扰、HRW处理的小鼠（HRW）；以及睡眠剥夺、HRW处理的小鼠（HRW+DEP）。

我们在前额斜纹核神经元（DB，图6）中未观察到富氢水对cFos+细胞数量的影响。虽然富氢水处理在外侧隔区（LS，图7）、内侧隔区（MS，图7）、腹侧视前区（VLPO，图8）和正中视前区（MnPO，图9）中产生了显著效果。

我们还观察到6小时急性睡眠剥夺对MS、LS、VLPO和MnPO中的cFos免疫反应的影响。结果在MS和LS中与以前的报道一致，但睡眠剥夺在VLPO和MnPO中引起的cFos免疫阳性细胞的增加似乎尚未在小鼠中得到报道，尽管有许多关于这些区域存在睡眠活跃神经元的报告。最后，双因素分析表明所有感兴趣区域的主要治疗效果，以及MS、LS、VLPO和MnPO中的主要睡眠效果（表3）。Bonferroni后测试揭示了具有统计学显著差异的多次比较（图7-9），并且在DB中的效果是特定于恢复睡眠的中等效果（图6）。

图8 氢水饮用对动物腹侧视前区cfos阳性细胞的影响。

四、讨论

这项研究对成年野生型C57BL/6J小鼠进行了随机、受试内的研究，探讨了富氢水与睡眠-觉醒行为之间的关系，以测试富氢水是否足以改变睡眠-觉醒结构这一假设。在活动期连续7天自由饮用富氢水后，收集了24小时的基线多导睡眠图（PSG），然后进行6小时的睡眠剥夺和随后的18小时恢复期。结果显示，经过7天的富氢水处理后，小鼠的平均入睡潜伏期显著缩短了超过50%（图1A），而日常的睡眠-觉醒节律和恢复睡眠的典型结构并未发生改变（图2）。值得注意的是，目前用于治疗失眠的一些药物可能只能将入睡潜伏期缩短不到20%。我们还观察到，在未受干扰的小鼠中，基线期间短暂的觉醒次数显著减少（图4A），但在睡眠剥夺后并未减少（图4B），这与预期一致，因为在对照组处理条件下，短暂的觉醒次数显著减少。富氢水处理组小鼠短暂的觉醒次数减少并未伴随着非快速眼动（NREM）睡眠阶段数量或持续时间的显著变化（图4C-F）。在每个处理条件的基线期间，总NREM和REM睡眠量均未发生变化（图4A,C）。需要注意的是，计算短暂的觉醒次数时并未结束“中断”的睡眠阶段。

在经历睡眠剥夺后，富氢水处理组的小鼠经历了显著增加的NREM（图3B）和REM（图3D）睡眠，这似乎主要是由活动期睡眠行为的差异所驱动。有可能富氢水对恢复期睡眠的影响仅特定于活动期，因为紧随6小时的睡眠剥夺后，睡眠压力已经接近其上限（注：困急眼了，氢水失去了效果）。尽管之前尚未报告过富氢水在小鼠体内的半衰期，但其他模型物种的数据显示，氢气在体内可持续存在数小时，尽管其在小型哺乳动物体内的保护作用可能在施用后的几天内持续存在。尽管我们报告了行为学上的睡眠压力指标（入睡潜伏期、NREM数量和睡眠巩固）的变化，但混合效应分析和多次比较以及Benjamini和Hochberg校正显示，富氢水对未受干扰条件下的NREM相对delta功率以及从睡眠损失中恢复的过程中并无影响（图5）。可能是SWA并不是一个足够敏感的指标来反映富氢水引起的睡眠压力的微妙变化。也可能是与睡眠稳态无关的直接活动变化驱动了富氢水对睡眠的影响。

为了阐明富氢水对几个与睡眠相关的前脑核的作用，我们在4组之间进行了前脑、下丘脑和中脑结构的cFos免疫阳性细胞映射：未受干扰、未处理的小鼠（CON）；未受干扰、未处理的小鼠（CON+DEP）；未受干扰、富氢水处理的小鼠（HRW）；以及经历睡眠剥夺、富氢水处理的小鼠（HRW+DEP）。我们在这里报告了与睡眠和觉醒相关的前脑结构的区域特异性变化。三因素方差分析（ANOVA）后 Bonferroni 事后检验显示，富氢水处理导致的神经元激活变化在很大程度上不受性别影响（表S1）。

纹状体是一种功能和化学上异质的前脑结构，常涉及调节社会行为、压力和进食。最近的研究显示，纹状体可以从海马体接收与睡眠相关的信号]。激活LS中的GABA能神经元足以显著增加NREM睡眠量。MS反复被认为参与应激调节，接收来自侧向下丘脑产生的食欲素神经元的觉醒促进投射。我们报告了LS和MS神经元中cFos+细胞数量在富氢水处理后显著增加（图7, 表3）。虽然不清楚观察到的HRW处理小鼠中睡眠变化与前脑结构中细胞活性的增加之间的方向关系，但这可能反映了局部抑制性中间神经元的活动。

下丘脑核团长期以来一直被认为是睡眠和觉醒的重要角色。视前区的GABA能和伽马氨基丁酸能神经元向重要的觉醒促进核团如结节乳头体核（TMN）发出抑制性投射。光遗传刺激这些视前区神经元会导致小鼠SWA增加。化学遗传激活VLPO中的伽马氨基丁酸能神经元可以显著缩短睡眠潜伏期。Kroeger等人和其他人的研究表明，视前区的抑制性神经元可能是哺乳动物睡眠稳态组织的核心。在这里，我们报告说富氢水足以增加几个重要的睡眠压力指标，但重要的是，我们报告说NREM SWA没有改变。

对于个体和社会来说，充足的睡眠不足会带来各种问题。长期的睡眠丧失会缩短生命和健康寿命 并增加发生交通事故的风险 。复杂的环境、行为和社会经济因素可能使人们难以经常获得足够的休息机会。即使有足够的休息机会，像失眠这样的睡眠障碍也会使正常的睡眠变得困难。新兴技术为个人提供了个性化的见解，研究人员可以获得生态学上有效的睡眠评估 ，然而，尽管公众和科学界长期对此感兴趣，但对于不良和紊乱的睡眠的治疗选择仍然有限。

氢元素和氢气是宇宙中最丰富的化学物质。作为一种治疗手段，氢气无毒性，没有已知的致命剂量或有害副作用。它已经证明能够减少氧化应激，上调重要的免疫途径，抵消化学和生理挑战的影响，并改善各种代谢状况。睡眠障碍在帕金森病患者中很常见，患者和床伴经常报告失眠和白天嗜睡。6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的帕金森病是一种常用的帕金森病大鼠模型，其特点是通过给予神经毒素选择性快速破坏儿茶酚胺能神经元。急性给予富含氢气的水在6-OHDA给药前后立即给予足够量，可以(a)改善这种帕金森病模型的典型多巴胺能细胞损失，(b)改变与多巴胺相关的行为。

黑质是多巴胺产生的地方，其退化是帕金森病的标志之一，也是一个重要的睡眠调节区域，在调节觉醒和REM睡眠方面起着重要作用。急性给予富含氢气的水已经证明能够在化学挑战期间调节睡眠相关的进程（免疫、代谢），并在已知的睡眠调节区域中起到神经保护作用。这些观察结果可能解释了本研究报道的结果。

五、研究结论

富含氢气的水对睡眠-觉醒结构和睡眠巩固具有可处理的效果。它减少了小鼠在光照开始后入睡所需的时间，并减少了睡眠-觉醒碎片化。在从睡眠剥夺中恢复期间，富含氢气的水增加了NREM和REM睡眠的量。富含氢气的水还增加了大脑中睡眠调节区域的神经元激活，特别是在VLPO和MnPO中。由于这些脑区的神经元激活与促进睡眠有关，因此这些结果表明富含氢气的水正在改变神经元对睡眠状态的调节，可能是患有睡眠质量低下的个人的一种有希望的补充剂。

限制 这是首次直接研究富含氢气的水和小鼠睡眠之间的关系。我们尽一切努力确保负责任地评估富含氢气的水影响觉醒状态和从睡眠损失中恢复的能力，包括明确定义的正面控制以进行反向测试，避免瓶子更换带来的意外后果的行为（假）环境干扰，盲法评分觉醒行为，以及定期进行内部评分者可靠性测试以确认评分者之间的高度一致性（>95%）（见方法）。这项工作的一个限制是睡眠评估实验中的自由给予富含氢气的水。这种给药途径是有意选择的，因为提供更大剂量和时间控制的其他给药途径（如口服灌胃）会产生焦虑，并且会显著混淆我们对PSG评估的觉醒状态。我们相信我们的实施方式合理地反映了可能的真实世界条件；尽管承认的是，富含氢气的水更可能在一天或多次分次以单次剂量给予，就像在人类试验中所看到的那样。

确定小鼠和人之间分子氢的相对剂量是复杂的，因为关于分子氢的治疗能力可能存在几个因素。大量证据表明，氢气作为一种线粒体应激效应器发挥作用[64]，同时也以剂量依赖的方式发挥作用。与其他激素应激物一样，当应激过大时，最终会出现平台和下降，但到目前为止尚未观察到这种下降。相对剂量可以根据小鼠的平均体重和水的消耗量来计算，并将其与临床试验中的人类消耗量（以mg/氢气为单位）进行比较。然而，将mg/氢气消耗量的一对一比较可能会误代表生理相关剂量，因为人和小鼠之间的差异不仅限于质量。例如，人们假设氢气可以驱动肝脏的内稳态。药物代谢动力学研究表明，进入肝脏的氢气的一部分以尚不清楚的方式进行代谢。据估计，小鼠的代谢率比人类高12.3倍，目前还不清楚肝脏代谢如何或是否改变氢气的药物代谢动力学特性，或者增加其治疗特性。

本文报告的IHC研究中的口服灌胃（和假灌胃）实现了对富含氢气的水给药的时间控制的更高水平。然而，由于之前已经证明富含氢气的水在不同模型中具有剂量依赖性效果，因此通过灌胃急性给予的区域可能与改变睡眠行为后的未知机制完全分离（如果有的话）。上述实验的结果充分证明了使用更具侵入性的体内工具（例如光遗传学、化学遗传学），并与PSG并行使用，以阐明睡眠调节系统在HRW相关睡眠变化中的作用的必要性。最后，虽然这里报告的早期基因活性没有提供细胞类型特异性信息，但这些结果代表了阐明富含氢气的水对小鼠睡眠促进作用机制的重要的第一步。