我们知道，水可水解成氢离子或质子，质子浓度可以用pH表示，pH水平和身体功能密切相关，血液和细胞外液数弱碱性的pH水平在7.4左右，而细胞内溶酶体则是酸性，线粒体内也存在巨大的质子梯度，膜内外的酸碱差异巨大。胃液内pH可以达到2，而小肠内则超过8。这些都是身体正常生理功能维持不可缺少的条件。质子跨膜转运是形成和调节酸碱梯度的基础，最近这些年研究发现，地球生命的产生可能就是自然条件下如海底白烟囱微观质子梯度形成为基础的。

关于质子的生命科学问题非常多，最近《自然》杂志发表一篇论文，研究了大脑内质子泵在神经元通讯的关键调节作用。特别重要的是，这一发现可能意味着人们对单分子生物学功能层面认识的突破。原来生物分子功能调节可能不是线性的，而是普遍量子化的。Kosmidis, E. et al.发现v - atp酶将质子泵入神经元细胞之间突触连接处的囊泡中，对神经元通信至关重要。对单个v - atp酶分子的观察显示，它们在质子泵送、静止和泄漏模式之间随机切换，每一种模式都持续几分钟，这对神经传递具有潜在的意义。 Nature 611, 827-834(2022)。

Regulation of the mammalian-brain V-ATPase through ultraslow mode-switching | Nature

项目

v -ATP酶是一种能分解ATP分子并将质子泵过细胞膜的酶。因此，它们对于细胞内大多数膜结合细胞器的酸化是必不可少的。在神经元细胞中，v - atp酶建立的质子梯度为神经化学信使(神经递质)加载到突触囊泡提供能量，随后在突触连接处释放。尽管v - atp酶在突触囊泡负载中起着至关重要的作用，但每个突触囊泡只包含大约一个v - atp酶分子(图1a)。因此，单个v - atp酶分子功能的任何基于概率(随机)的变化都可能影响突触-囊泡负载和神经元通信。据我们所知，我们第一次监测到单个突触囊泡中单个v - atp酶的质子泵出。每个囊泡只有一个分子，这就存在单分子效应生理现象了，大概也需要量子力学进行研究了。 

图1 |质子泵酶v - atp酶在模式之间切换。a，突触囊泡膜(灰色)中v - atp酶蛋白(暗粉色)的图示，其他膜蛋白用棕色和橙色表示。v -ATP酶分解ATP分子，生成ADP和一个磷酸基(Pi)，并将质子泵入囊泡。这会使囊泡酸化并产生膜电位(∆Ψ)。当v - atp酶被泵入(箭头进入囊泡)时，质子通过膜或v - atp酶蛋白泄漏出去。b，在囊泡中观察到pH指示器(标准化强度)的荧光，它反映了它的质子梯度。v - atp酶在质子泵浦模式(吨)、非活性模式(第一和第二个灰色关闭期)和随机转蛋白介导的“质子泄漏”模式(第三个灰色关闭期)之间随机切换。这就导致了囊泡中质子梯度的“全或无”波动。

这一发现

为了直接观察单个突触囊泡在数小时内的酸化情况，我们从大鼠大脑中分离出突触囊泡，并在每个囊泡中装入16至300份荧光ph指示剂。然后我们将突触囊泡以低密度固定在玻璃上，这样我们就可以使用荧光显微镜对它们进行单独成像。我们加入ATP启动突触囊泡的酸化，并使用两种计算方法分析了单个突触囊泡的酸化动力学。其中一种方法被称为贝叶斯事件检测，用于估计v - atp酶活性发生变化的时间。第二种方法模拟了质子泵的动力学。

我们的数据显示，v -ATP酶不会及时连续泵出质子，正如在细菌中观察到的类似泵，以及假设ATP击穿和质子泵出之间存在严格耦合的模型所提出的那样。相反，V-ATPases在三种长寿命模式之间随机切换，每一种模式都持续几分钟:质子泵浦模式、非激活模式和质子泄漏模式(图1b)。出乎意料的是，我们的观察结果显示，通常在细胞中发现的ATP浓度并不调节v -ATP酶的固有泵送速率。相反，ATP的浓度影响v -ATP酶分子切换到质子泵模式的概率。相比之下，囊泡膜上的质子梯度可以调节泵浦速率，以及泵浦模式和非泵浦模式之间的切换。这些结果揭示并强调了蛋白质功能模式之间的“超低”切换的机制和生物学重要性。

 A proton-pumping enzyme in the brain switches between modes (nature.com)

几十年来，人们认为v - atp酶等转运蛋白的功能调节是通过转运速率的增减来实现的。我们先前关于p型ATPases1和现在关于v型ATPases1的数据揭示了一个替代模型，在这个模型中，在传输速率固定的模式之间的转换概率是有调节的。值得注意的是，质子泵在进化过程中趋同，共享了与蛋白质传输其他离子和小分子不同的传输机制。

如果我们能够研究这些其他分子的转运，也在单分子水平上，在几个小时内，我们就可以验证一个有趣的假设，即通过超低模式切换调节转运是“初级”活性转运蛋白和“次级”活性转运蛋白的一般特性。主要的转运蛋白，如v -ATP酶，利用它们产生的能量(例如，通过分解ATP)在细胞膜上产生离子浓度梯度。这些梯度随后驱动或激活次级活性转运蛋白。

因为每个突触囊泡只有一个v - atp酶分子，模式切换的直接含义是在整个囊泡的质子梯度中存在随机的“全或无”波动。质子梯度的随机崩溃为神经递质的装载提供了能量，这可能对神经传递有重要的意义。

更广泛地说，许多膜受体蛋白和酶被认为在纳米级结构域和纳米级细胞器中以几乎单分子复制数分隔。在这种情况下，超低模式切换是否存在，如果存在，它是如何影响下游细胞信号传递的，还有待观察。- Dimitrios Stamou和Eleftherios Kosmidis就职于丹麦哥本哈根的哥本哈根大学。

专家意见

作者使用一种聪明的技术在单分子尺度上表征和量化突触囊泡中v - atp酶的活性。这项研究触及了一个非常重要的生物学问题，并对突触-囊泡生物学和v - atp酶活性提供了一个潜在的新视角，这在以前没有得到重视。突触囊泡v - atp酶显示出动态异质性的特征，这一发现支持了单个分子模式切换可能具有重要的生物学功能的论点。斯科特·布兰查德(Scott Blanchard)就职于美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院。

故事背后，这是一个关于长期探索和突然发现的故事。 

我们的实验室大约在2004年开始记录单个转运蛋白的活性，不久之前，我们证明了单个固定泡囊可以在其膜上保持离子梯度，因此可以用来测量离子通量。然而，这个项目被证明是极其困难的，因此，12年后才首次发表了对重组活性转运蛋白的单分子测量结果。巧合的是，就在一个月前，另一个研究小组(包括这篇论文的作者莱因哈德·雅恩和茱莉亚·普雷奥布拉斯基)发表了一项关于从小鼠神经元中分离出的单个突触囊泡的成像研究。读到这篇文章对我们来说是一个“发现”的时刻，因为我们意识到，结合两个实验室的专业知识将使我们能够测试我们观察到的模式切换是否会导致突触囊泡中离子和神经递质浓度的波动。在2016年底，我们开始了一场卓有成效的合作，并最终形成了本文。