我最希望了解，使用这种新技术，可否看到纳米气泡？

2017年有连续几周，瑞士伯尔尼大学的生物化学家旺达·库库尔斯基(Wanda Kukulski)发现自己疯狂地观看一种不同寻常的细胞内部的视频。这是用一种叫做冷冻电子断层扫描(cryo-ET)的技术制成的视频，这种技术可以让研究人员以高分辨率观察细胞中的蛋白质。在这些视频中，她看到各种各样惊人的东西，比如细胞的内部运作和细胞内部的隔间，其细节之多前所未有。库库尔斯基(Kukulski)回忆说:“我被它们的美丽和复杂所折服，到了晚上，我就像看纪录片一样看着它们。”

近年来，诸如cryo-ET这样的成像技术已经开始使科学家能够看到自然环境中的生物分子。不像过去的方法，把单个蛋白质从小生境中提取出来研究，这些技术提供了蛋白质和其他分子以及细胞景观的整体视图。尽管这些技术仍有局限性，如分辨率太低，无法确定分子的身份，但这些技术正在变得越来越普及和复杂。研究人员不仅被这些美丽的图像迷住了，还被一些正在被揭示的秘密所震撼。比如细菌用来感染细胞的过程，或者突变蛋白质是如何导致神经退行性疾病的，比如帕金森氏症。

加州理工学院的结构生物学家格兰特·詹森说，通过显微镜的每一次观察都是探索未知细胞地形的又一次机会。他说:“第一次看到一些东西绝对是一种巨大的快乐体验。”

其他研究人员也分享了他的喜悦。加州大学圣地亚哥分校的生物物理学家伊丽莎白·维拉(Elizabeth Villa)回忆起她第一次用cryo-ET观察细胞结构时的激动心情。维拉说:“突然之间，我们仿佛成了拥有前所未有权限的狗仔队。”

从晶体到环境

几十年来，研究人员一直依靠x射线晶体学技术来可视化蛋白质、病毒和其他生物实体。该方法包括诱导分子形成静态的、有序的晶体，然后用强x射线束轰击样品。它使DNA的螺旋性质和超过10万种蛋白质的结构得以发现，但它也有其局限性:结晶分子方法困难而乏味，而且并非一定成功。

利用低温电子显微镜(cryo-EM)克服了这些缺点，这种技术可以揭示从周围环境中分离出来然后冷冻的生物分子的结构。在低温电子显微镜中，样品被电子束照射。虽然这项技术最初被嘲笑为“blobology”，但由于它产生的图像模糊，样品制备和图像处理的进步已经提高了它的分辨率，足以显示单个原子(大约1.2Å或1.2 × 10-10米大小)。

随着这种“分辨率革命”开始席卷低温电子显微镜，大约在2013年，科学家们蜂拥而至。到目前为止，研究人员已经用它解决了超过10000个生物分子的结构。在细胞膜中发现的蛋白质尤其令人感兴趣，因为其中许多蛋白质对了解疾病和开发药物都很重要。詹森说，这一进步“为一些真正有才华的人打开了大门，他们随后会寻找下一个最富有、最成熟的领域，以获得具有重大影响的进步”。

它的早期支持者寻求一种技术，这种技术不仅可以观察生物分子的细节，而且还可以观察细胞内部。和cryo-EM一样，cryo-ET需要电子显微镜，并依赖于一种被称为玻璃化的样品制备方法:快速冷却样品周围的水，使其冻结成玻璃状，而不是冰晶。然而，与传统的低温电子显微镜(cryo-EM)不同的是，它需要提纯的样本，研究人员可以使用低温电子显微镜在原位捕获这些分子。

利用低温电子显微镜，科学家们通过对许多不同构型的孤立分子拍摄2D照片，并将结果合并，从而获得3D图像。相比之下，使用cryo-ET，他们从许多不同的角度对一大块充满分子的物质进行多次快照，从而使周围环境保持完整。

这就像给一群人拍照，而不是给一个人拍照。德国马普生物化学研究所的生物物理学家沃尔夫冈·鲍迈斯特是这项技术的先驱之一，他和他的同事们将其命名为“分子社会学”。

毕竟，这就是蛋白质的生存方式。维拉说:“蛋白质是社会性的——在任何给定的时间，一种蛋白质都与大约10种其他蛋白质在一个复合物中。”在观察了与cryo-ET的这种相互作用后，“我无法接受自己单独研究另一种蛋白质的想法，”她补充道。

革命性的显微镜技术首次看到了单个原子

电子断层摄影术本身——使用电子显微镜从多个角度对标本进行成像——早在20世纪60年代就出现了，但直到20世纪90年代，这种方法才开始崭露头角。其中的一个挑战是，电子流对生物样本的破坏性极大，这使得捕捉足够的快照以获得清晰、清晰的图像变得困难。科学家们使用最新的样本切片过程和计算方法来锐化他们的图片。例如，一种叫做冷冻聚焦离子束(冷冻fib)的技术可以将样品切割成极薄的薄片，即薄片。Baumeister说，尽管如此，使用Cryo-ET所需的成本和技术专业知识——特别是与低温fib磨粉等方法结合使用——可能会让许多实验室望而却步。

鲍迈斯特研究小组对cryo-ET的早期展示包括盘基网柄菌(一种生活在土壤中的噬菌变形虫)细胞的快照。除了其他发现外，研究小组还揭示了阿米巴细胞骨架的复杂蛋白质网络以前未见过的特征，比如单个的丝状体如何相互作用，以及如何附着在盘基网柄细胞膜上的特定结构上。

鲍迈斯特说:“你很少能将生物功能或细胞功能分配给单个分子——这些功能来自于细胞景观中所有分子的相互作用。”“这就是Cryo-ET的发现潜力所在。无论我们现在看到什么，总会有惊喜。”

善于交际的细胞

cryo-ET的早期工作大多是在原核生物上:如细菌等单细胞生物。这些细胞通常比真核生物复杂的细胞更小更薄。

例如，在Jensen 2006年的一项研究中，他和他的团队报告了第一个驱动鞭毛(细菌中的鞭状附属物)的发动机的完整结构。利用cryo-ET，他们揭示了原始密螺旋体(一种在白蚁内脏中发现的细菌)中20片马达的结构，并详细说明了这些部分是如何在细菌膜中定位的。Jensen和他的同事还揭示了细菌毛的关键细节——微生物利用毛突起来实现许多功能，比如附着在它们感染的细胞上并将物质分泌到细胞中。去年，他的团队发布了一个开放获取的数字地图集(参见go.nature.com/3nugs7v)，突出了cryo-ET揭示的关于细菌和其他原核细胞的许多见解。

最近，科学家们已经开始对真核细胞进行成像——与原核生物相比，真核细胞更像宫殿。这在很大程度上是因为低温纤维纤维磨铣技术的出现，它允许研究人员在将细胞置于电子显微镜下之前将其切薄。鲍迈斯特和他的同事使用这种混合方法来可视化分子是如何在人类细胞的细胞核附近排列的(见“内部勺子”)。他们的工作揭示了以前从未见过的纳米细丝是如何为细胞核提供结构支持的——使其成为动物细胞中最坚硬的细胞器之一。

即使经过FIB研磨，cryot - et也只能捕获真核细胞的微小片段，这意味着科学家需要找到一种方法，在广阔而拥挤的细胞景观中找到感兴趣的分子。一种解决方法是先在光学显微镜下对蛋白质进行荧光标记，然后利用cryo-ET将特定部位的细节放大。

维拉和她的同事利用这种技术组合来解析LRRK2的结构，LRRK2是一种与帕金森氏病的遗传形式有关的蛋白质。他们的工作显示，突变的蛋白质粘附在细胞骨架的组成部分——微管上，在微管周围形成双螺旋结构。该团队的发现还暗示，突变的LRRK2可能会形成一种结构，促进这种类型的结合——通过阻断沿着微管携带重要细胞货物的分子，可能会导致问题。

这场革命不会具体化:一种新方法席卷了结构生物学

Baumeister等研究小组已经使用这种方法来研究与神经生成疾病(如亨廷顿舞蹈症和运动神经元疾病(肌萎缩侧索硬化症，简称ALS))相关的蛋白质是如何与细胞成分如内质网(ER)相互作用的。一种帮助合成蛋白质的细胞机器。研究人员发现，与这些疾病有关的神经毒性蛋白质团在细胞内的行为非常不同。例如，在亨廷顿氏舞蹈症中，一种被称为亨廷顿蛋白的突变型蛋白质的聚集似乎使内质网的组织混乱，而在ALS中，异常蛋白质的聚集通过激活其蛋白质降解机制损害了细胞的生物化学。

在未来，科学家们希望通过观察药物如何作用于细胞内部的分子，来更好地理解治疗方法是如何工作的。在早期的演示中，位于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室的Julia Mahamid和她的同事们能够在与核糖体结合的细菌细胞中发现抗生素。核糖体是作为蛋白质工厂的细胞器。这一壮举是通过将cryo-ET的分辨率提高到3.5 Å而实现的。

“我认为这可能是用cryo-ET可能实现的最先进的技术，”库库尔斯基说，他没有参与这项工作。然而，她注意到核糖体在细胞中无处不在，并且已经被很好地描述了，这使得它很容易识别和研究。她补充说，试图对鲜为人知或罕见的细胞结构进行成像仍然是一项极其困难的任务。

强大的组合

Cryo-ET是一个快速发展的领域，但这项技术仍然有一些局限性。解决方案仍然是一个问题。尽管近年来细节水平有了显著提高，但cryo-ET仍无法达到cryo-EM的原子级分辨率。加州大学洛杉矶分校的生物物理学家Zhou Hong说:“Cryo-ET与90年代早期的cryo-EM相差甚远，那时的cryo-EM还无法实现原子分辨率。”

周说，在目前的性能水平上，用Cryo-ET来正确识别细胞中的分子是很困难的。因此，除非科学家们正在研究的结构已经被很好地描述了，如核糖体，否则他们关于他们用这项技术看到的东西的假设可能会被证明是错误的，他补充道。“胜算不大。我们很容易犯错误。”

为了回避解决问题，周选择尝另一种可以捕捉整个细胞图像的x射线断层扫描技术相结合。这使得科学家可以检查更大的组成部分的结构，如线粒体或细胞核，然后放大到特定的感兴趣的区域。

然而，将这些方法结合在一起需要金钱和技能。最重要的是，这两种技术都用破坏性的辐射轰击样本。西班牙巴塞罗那ALBA同步加速器设备的光束科学家Eva Pereiro说，这使得在他们之间转移样本成为了一个挑战。该设备生产适合于断层扫描的x射线。

一些实验室已经完成了这一壮举。玛丽亚·哈尔奇奥拉基(Maria Harkiolaki)是英国迪德科特(Didcot)同步加速器钻石光源(Diamond Light Source)的首席束线科学家，她和同事最近发表了一个SARS-CoV-2感染机制的模型，该模型使用Cryo-ET和x射线断层扫描来阐明这一过程。他们捕捉到了细胞和单个分子水平的事件，并提出了病毒如何在灵长类细胞中复制的想法。

鲍迈斯特认为，像低温em一样，Cryo-ET最终将使科学家能够从原子的细节上观察生物分子。在那之前，科学家们将继续热切地研究，通过冷冻et和其他类似的方法，可能会对细胞有什么样的了解。因为这些工具可以揭示以前从未见过的结构，研究人员经常留下新的谜题来解决。维拉说:“我喜欢断层摄影的原因是，我们总是产生更多的问题而不是答案。”