土壤氢菌是打开氢气生物学困境的一个缺口

氢气生物医学领域的重要科学问题就是对氢气的作用机制不清楚，但是在细菌代谢领域，氢气的生理作用非常明确，对这些作用表型的深入研究有利于寻找氢气作用的生化基础，理解这些效应对于分析氢气在人等动物植物细胞中的作用机制具有非常重要参考价值。氢气医学学者应对这方面的研究非常感兴趣，希望有更多微生物代谢学研究者能和氢气医学研究者进行更密切交流合作，这可能成为打破氢气医学研究困境的一个重要缺口。

这个内容有两个价值，一是关于土壤氢气相关研究，另一是关于氢气和生命进化关系。氢气在整个生物界都具有及其重要作用。对于地球生态系统，特别是微生物界，氢气可能是生物能量维持系统，在能量缺乏的恶劣生存环境，因为有了来自大气环境的氢气，让这些微生物具备可持续生存下去的基本条件。某些微生物物种，所以能在及其恶劣的环境下生存，可能得益于氢气贡献出的电子，虽然能量有限。如果没有氢气，某些微生物物种可能无法生存，如果没有氢气，复杂生命祖先可能无法保持物种复杂度，地球演化出单细胞真核生命会存在困难，更不要说植物人类的出现了。如果要感谢送给我们生命的某一种元素，非氢末属！因为地球生命进化离不开氢气的呵护。

生命起源和进化有两个基本阶段，一是从无机物向有机物的进化，二是生命从低级到高级的进化。氢气在各种不同的生命进化假说中具有绝对重要地位，因为在有机物进化、生命起源和复杂细胞进化中，都离不开氢气的身影。

地球早期大气富含还原性气体，如氢气、一氧化碳和甲烷。这些气体也是许多生命起源的环境条件。氢气无处不在，其活化能需求很低，非常容易变成氢原子与其他物质发生化学反应，最常见的化学反应是氢气还原其他氧化底物，例如氧气。这种氧化还原反应可释放出化学能，可给生命过程提供了能量。

更重要的是，氢分子扩散能力极强，这给氢气作为生命第一电子供体提供了条件（氢思语：氧气是需氧生物细胞唯一最终电子接受体），能给线粒体离子梯度产生提供能量，质子梯度是细胞合成ATP的前提。

铁硫中心生命起源假说认为，NiFe/FeS活性中心类似于氢化酶活性位点，可催化氢气转化为质子和电子，这一过程可能在10亿年前进化出现，导致最早氢气制造和氢气消耗微生物群。在许多生态位中，氢气浓度可能代表一种环境选择压力，今天微生物界仍然维持这种古老代谢模式，如大肠杆菌、疣微杆菌门和胃幽门螺杆菌等。

氢化酶在生命树中有很好的代表，因为它们在30多个门的数千个基因组中被发现(图1-3)。包括人类和植物基因都包含这种基因，估计数量远远超过30个门。（保守方法将细胞生物分为7个界：动物界、植物界、真菌界、原生生物界、色藻界、细菌界、古菌界。门，目前可以分117个：动物界32个、植物界8个、真菌界7个、原生生物界10个、色藻界13个、细菌界29个、古菌界2个、病毒界16个。有许多生物尚未分类到任何一个门。）

氢化酶支持各种生态系统中自养和混合营养生活方式，包括土壤、水生和动物相关的生态位。生态位又称生态龛，表示生态系统中每种生物生存所必需的生境最小阈值。土壤微生物主要指的是生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称，是土壤不可或缺的重要组成部分。这些细小到肉眼看不到的微生物，是土壤生物肥力的核心，也是土壤生命的重要“调控者”。

土壤微生物生长往往受到碳源和营养物质匮乏的限制，只要不影响生存，即使营养不足微生物也能迅速生长。氢气在环境中普遍存在，只需要较低的活化能，且易于渗透进入微生物细胞。氢气的普遍存在主要是由于其对物质的高穿透能力，以及地球地幔中非生物生成氢气和通过生物发酵、固氮等过程产生氢气。在大多数生态系统中，氢气可还原多种氧化剂。氢气可提供快速能量补充，帮助微生物克服短期或长期饥饿生存间隔。有人从热力学和生物能量的角度计算了这个最小的能量需求。

图1 铁氢化酶进化树。25条铁氢化酶基因，每个基因编码389个氨基酸序列的蛋白质，蛋白序列来自格林等的研究数据。

图2铁铁氢化酶进化树。1217个基因，每个基因编码3525个氨基酸。

图3 镍铁氢化酶进化树。1988个基因，编码1850个氨基酸。

主要参考文献

[1] S Piché-Choquette, 一氧化碳nstant P . Molecular hydrogen, a neglected key driver of soil biogeochemical processes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2019.

[2] Morita RY. Is H(2) the Universal Energy Source for Long-Term Survival? Microb E一氧化碳l. 1999 Nov;38(4):307-320. doi: 10.1007/s002489901002. PMID: 10758178.（氢气是生命生存的宇宙能源？）

当环境条件不适合生长时，细菌会进入长期静止期甚至休眠期，氢气氧化提供能量，对恰如久旱逢甘露，使休眠的细菌暂时复活。这种生活方式可能将饥饿生存与另一种生存机制结合起来，如脱水或低温生存(即冷冻)，就像被困在琥珀中或冻土层中的微生物一样。代谢不活跃的生活方式大大减少了能量需求，但微生物细胞仍然需要通过不断修复细胞损伤或重新合成DNA来防止氨基酸外消旋化和DNA去嘌呤化，这需要持续的能量输入。生物靠负熵生存，饥饿的细菌靠氢气维持生命延续，氢气在这里扮演者救世主角色。当有机质和氢气大量存在时，氢气氧化微生物可从短期或长期的休眠状态转变为代谢更活跃的生活方式。

最近研究表明，氢气在自然界和工程生态系统中的普遍存在和重要性，但氢气生物学研究领域一直被忽视，很少有研究小组关注生态系统水平上的生物氢气动态。本综述的目的就是讨论氢气作为维持微生物活力和活性的能源的潜在作用，进而成为维持土壤生物地球化学过程。首先，简要介绍氢化酶的分类和生理作用，重点介绍了氢化酶动力学特性和抗氧能力。部分描述了在有氧和缺氧土壤环境中产生和氧化氢气的细菌类型。然后，结合氢化酶的生化特性，提出不同类型氢气氧化微生物沿土壤氧气梯度的分布模式，以及在碳循环中的潜在意义。最后，对氢气氧化微生物在土壤生物地球化学过程中的贡献进行了展望。

一、氢化酶分类概述

氢化酶是催化氢气转化为质子和电子的金属酶，反应如下：氢气⇌2H⁺ + 2e−。这些酶要么用来提供能量，还原代谢辅助因子，要么用来缓冲无氧代谢过程产生的还原底物。结构亚基之间电子桥的构象和蛋白质的定位决定了它们的生理作用。根据它们的活性位点和氨基酸序列的不同，分为[Fe]-氢化酶、[FeFe]-氢化酶和[镍铁]-氢化酶三种类型。根据三级结构、催化活性和分类学分布明显不同，推测这些分类可能起源于聚合而不是顺序进化。由于氢化酶的模块化结构，水平基因转移也很常见。因此，一些微生物，如变形菌门和耻垢分枝杆菌(放线菌门)，具有表达多种不同生理作用的氢化酶基因组的能力，这增加了代谢的灵活性。

1、[Fe]-氢化酶。

[Fe]-氢化酶是由两个38-kDa亚基组成的同型二聚体，催化中心有一个Fe原子。与[FeFe]-和[NiFe]-氢化酶相比，[Fe]-氢化酶不含Fe-S簇，仅限于广古菌门的氢养产甲烷古菌，且不被氧气灭活。在镍限制条件下，[Fe]-氢化酶与依赖于F420的亚甲基四氢甲基脱氢酶共同作用，使源自氢气氧化的电子成为甲烷生成的基础。

2、[FeFe]氢化酶。

[FeFe]-氢化酶是单、二、三或四聚酶，含有两个铁原子的活性中心，称为H团簇，以及Fe- s团簇。[FeFe]-氢化酶严格厌氧，活性部位会因氧气暴露而发生变性。[FeFe]-氢化酶几乎只产生氢气，但也有少数例外，如变形菌门的脱硫弧菌，其[FeFe]-氢化酶可在镍限制条件下氧化氢气，从而绕过[NiFe]-氢化酶的合成。[FeFe]-氢化酶主要存在于厌氧厚壁菌门和硫酸盐还原菌中。[FeFe]-氢化酶是唯一在真核生物中发现的氢化酶类型，即在单细胞绿藻衣藻中(绿藻门)，位于其中氢化酶体和叶绿体内。

3、[NiFe]-氢化酶。

[NiFe]-氢化酶是分布最广泛的氢化酶。一些结构和附属基因是它们成熟所必需的。虽然[NiFe]-氢化酶可以是多聚体，但至少包含一个异二聚体核心成分，其中包括一个大的α-亚基(约60 kDa)和一个小的β-亚基(约30 kDa)。[NiFe]-氢化酶代表一组异质性氢化酶，根据系统发育(图3)和生理功能可分为5个亚组。在这些生理特性中，最常见的是对氧气耐受和氢气低亲和力。事实上，只有少数亚基对氧气敏感，其中单个亚基对氢气具有高亲和力，即能氧化大气中痕量氢气 (0.53 ppmv)。

(1)1组[NiFe]-氢化酶。

1组 [NiFe]-氢化酶(膜结合氢化酶[MBH])是附在细胞质膜上的氢气摄取氢化酶。它们通过细胞色素b为醌库提供电子，与电子传递链紧密相连，导致化学渗透和随后生成的ATP。MBH通过耦合氢气氧化和还原几个电子受体，如二氧化碳、硫酸根、硝酸根、Fe(III)氧化物或氧气来产生能量。1组 [NiFe]-氢化酶主要分布在变形菌门和厚壁菌门中(分别为62.5%和17.3%)(图3和S3)。在产甲烷古菌和硫酸盐还原菌中发现的原始MBH对氧气敏感。相反，在专性和兼性自养生物中与Isp复合物相关，在γ变形菌门中与HybA-MBH相关，对氧气耐受性较低。耐受氧气的MBH被用来进行Knallgas反应，即以氧气作为末端电子受体氧化氢气，或其他涉及高电位电子受体如氮氧化物或细菌叶绿素的反应。

(2)第2组[NiFe]-氢化酶。

第2组[NiFe]-氢化酶由细胞质酶组成，分为2个不同的功能基团，2a和2b。[NiFe]-氢化酶包含2a组，是由氮固定或NADH/NADPH氧化产生的内源性氧化氢气的可溶性摄取氢化酶，主要存在于蓝藻和其他氮固定细菌中(图3和S3)。它们的作用是引导电子进入电子传递链并向细胞提供能量。它们通常位于缺乏氧气光合作用的蓝藻杂囊内，由于对氧气敏感，在缺氧条件下上调。相比之下，2b组[NiFe]-氢化酶是氢气敏感的调节性氢化酶(RH)，作为双组分信号转导系统。疏水气体通道的特殊形状和大小导致外源性产生的氢气进入活性位点，赋予了酶对氧气的耐受能力。当氢气存在时，调节性氢化酶诱导Knallgas细菌中1组和3组摄取氢化酶操纵子的转录。

(3)3组调节性氢化酶。3组 [NiFe]-氢化酶是一种细胞质酶，称为双向异源性[NiFe]-氢化酶或可溶性氢化酶(SH)。它们的作用是在细菌和古菌细胞内提供氧化还原平衡。这些酶的结构亚基与结合可溶性辅助因子的蛋白质模块密切相关。3组[NiFe]-氢化酶对氧气具有耐受性，这是由于其活性位点的Ni和Fe原子上结合了两个额外的氰化物配体。这些氢化酶主要存在于变形菌门(37.4%)和广古菌门(27.4%)中(图3和S3)，进一步细分为4个亚群。3a组[NiFe]-氢化酶是异三聚体，最初发现于产甲烷古菌，但最近发现于一些细菌门，用于还原F420辅助因子。3b组[NiFe]-氢化酶是四聚体，类似于双功能磺氢酶。它们最初是在嗜热古菌中发现的，最近也在细菌门中发现。它们将硫还原为硫化氢或氧化NAD(P)H并产生氢气，以分解发酵产生的还原性底物，也可以使用氢气产生NADPH。3c组[NiFe]-氢化酶是异二硫还原酶相关的氢化酶，催化甲基橙素和辅酶m -二硫键辅酶B等化合物的还原，主要发现于产甲烷菌和硫酸盐还原剂中。3d组[NiFe]-氢化酶由一个杂聚型氢化酶和一个NADH脱氢酶模块组成，它与NAD(P)H结合。氢化酶亚基的数量变化很大，例如，由C. necator中的异二聚体酶或蓝藻中的异五聚体酶组成。这些氢化酶被用来平衡NAD+/NADH池，通过使用氢气还原NAD+。

(4)第4组[NiFe]-氢化酶。4组[NiFe]-氢化酶或膜相关能量转换酶是氧敏感的多聚酶，包括嵌入在细胞质膜内的两个蛋白质以及亲水亚基。类群4[NiFe]-氢化酶主要存在于产甲烷古菌、化能自养细菌和嗜热古菌中(图3和S3)。在兼性化能自养生物中，第4组氢化酶通过将水中质子的还原与一碳化合物(如甲酸或一氧化碳)的厌氧氧化耦合在一起，分散发酵产生的还原当量。在乙酰碎屑产甲烷菌中，能量转换氢酶(Ech)执行依赖氢气的铁还蛋白还原，导致通过细胞质膜产生质子梯度和生成ATP。在没有细胞色素的产甲烷菌中，第4组[NiFe]-氢化酶(Eha和Ehb)还原铁还蛋白并催化氢气氧化，然后再与钠离子动力的产生耦合。4组[NiFe]-氢化酶也包括能转化的MBN型嗜热酶，产生氢气，以重建氧化铁还蛋白水平。

(5)第5组[NiFe]-氢化酶。5组[NiFe]-氢化酶是耐受氧气的摄取氢化酶，对氢气有很高的亲和力，能够氧化大气中痕量氢气。它们的活性首先在链霉菌属(放线菌门)的孢子中被发现。这些酶可能通过一个电子受体与细胞膜的胞质侧相联系，但有报道称有矛盾的结果。基因组数据库挖掘显示，第5组[NiFe]-氢化酶主要存在于放线菌(84.0%，图3和S3)。这些氢化酶的作用是提供生长优势或生存-混合营养生活方式的补充能源，以维持寡营养环境中的微生物种子库。然而，C. necator有一个弱表达5组 [NiFe]-氢化酶，不能氧化大气中的氢气。事实上，产生氢气高亲和力的生化特性仍然未知。而两者之间有很高的序列相似性5组[NiFe]-氢化酶活性位点，但这种氢化酶表现出亲和力相差巨大，例如，C. necator的亲和力超过1000 ppmv，而链霉菌sp.菌株PCB7的亲和力为11 ppmv。这表明，要么是C. necator的侧向基因转移，要么是在高亲和性氢气氧化菌中存在未知的氢化酶生化属性的进化。或者存在其他未知因素，如目前未知的第5组[NiFe]-氢化酶的生理电子受体，它们可能是导致氢气高亲和性的原因。不过这些氢化酶的氢气亲和性尚未在体外全面测试。

氢思语注：任何蛋白质如果对氢气存在亲和力差异，强烈说明氢气和蛋白分子之间存在物理相互作用。由于氢气缺乏极性，蛋白质和氢气的亲和力化学基础也不清楚，这背后的机制对于理解氢气的生物学作用及其重要。因此关于氢化酶催化活性的研究是研究氢气作用机制的捷径。

二、氢气生物地球化学循环

在有氧和缺氧生态系统中，微生物产生和利用氢气都普遍存在。在湿地、化变层下淡水、海洋沉积物、动物胃肠道等缺氧生态系统中，氢气主要作为来自三个生命域生物代谢有机物生物降解反应中间体。在缺氧生态系统中，分解氢气的主要微生物包括产乙酸菌、产甲烷菌、硫酸盐还原菌、铁氧还菌和硝酸盐还原菌（厌氧环境中消耗氢气的细菌类型似乎不太多）。在旱地土壤、化学变层上方淡水、开阔海洋等有氧环境中，氢气主要由氮气固定产生，由Knallgas细菌和高亲和力氢气氧化菌消耗。由于其能量潜力，在相同的微环境中，氢气会被微生物快速消耗，这表明氢气的产生可能是氢气生物地球化学循环的限制步骤（氢思语：肠道内是否也存在类似情况，大部分氢气都被就地解决了，这样被人体吸收的氢气有限，导致人体细胞难以享受到氢气的恩泽）。以下内容将介绍在有氧和缺氧生态系统中负责氢气生产和利用的微生物功能组，以展示它们的巨大多样性和它们在生物地球化学循环中作用。

1、缺氧生态系统的氢气产量。

在缺氧生态系统中，光合作用(或生物光解)、暗发酵和光发酵负责大部分氢气的产生。

(1)光合作用生氢。水生沉积物中光合作用产氢气主要是单细胞藻类，如绿藻门小球藻(Chlorella fusca)、斜齿四棱藻(Tetradesmus obliquus)(原斜齿四棱藻;绿藻门)，莱茵衣藻，以及蓝藻细菌。土壤中有几种紫色非硫细菌进行光合作用产氢，包括变形菌门(Rhodobacter capsulatus)和红假单胞菌门(Rhodopseudomonas rutila)。这个过程发生在氧气和二氧化碳缺乏情况。光激发电子通过光系统转移以还原铁还蛋白，然后铁还蛋白通过[FeFe]-氢化酶被氧化以产生氢气。这个过程维持了电子传递链中的电子流，一旦更好的条件出现，比如变化的潮汐或下一个光周期，就恢复含氧光合作用。无氧情况下，氢气作为电子受体释放到环境。有氧气情况下，电子被氧气接受，能产生或转化电子的更多能量。

(2)光发酵和暗发酵。单细胞藻类如Fragilariopsis(硅藻门)和Pyramimonas(绿藻门)，严格厌氧菌如Clostridium acetobutylicum(厚壁菌门)，甚至水生和陆地环境中的兼性厌氧菌，如大肠杆菌(变形菌门)，也可以通过暗发酵产生氢气（氢思语：肠道内产氢气的菌可能就是后两类）。糖酵解，接着丙酮酸脱羧成乙酰辅酶A (acetyl-COA)，将铁还蛋白/NAD+还原为氧化铁还蛋白/NADH，向氢化酶提供电子并通过它们的再氧化生成氢气。另外，辅酶A和丙酮酸转化成甲酸和乙酰辅酶A，然后甲酸裂解，也导致氢气和二氧化碳的生成。氧化铁还蛋白和NADH通过丢弃还原等价物再生，糖酵解可重新生成ATP。光发酵由紫色非硫细菌(例如红藻(Rhodospirillum rubrum)[变形菌门]或球形红藻(Rhodobacter sphaeroides))进行的，它们可利用光能将乳酸等有机底物转化为氢气和二氧化碳。假设有黑暗和光照的循环，这些过程可以按顺序执行。根据基因组调查和依赖培养的测量，在水生环境中，释放氢气的发酵菌包括单细胞藻类、厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门和变形菌门。在稻田等缺氧土壤中，针对[FeFe]-氢化酶的分子调查显示，厚壁菌门(主要是梭菌门)、变形菌门(主要是三角洲变形菌门)和氯氧化菌是最丰富的氢气产生菌。同样，在中等酸性沼液富集中，产氢气发酵菌为厚壁菌门(梭菌和负菌门)和三角洲变形菌门。

(3)固氮产氢。各种微生物，如梭菌属和芽孢杆菌属(厚壁菌门)，以及产甲烷古菌和蓝藻细菌可在缺氧或微氧环境中固定氮气并产生氢气。目前估计表明，大多数生物固氮是在有氧生态系统中进行，特别是在地表水和豆科和放线菌植物的根际，这将在下一节讨论。

2、有氧生态系统的氢气产生。

固氮作用。生物固氮(BNF)是高氧生态系统产生氢气的主要生物过程。固氮酶配合物按以下反应进行生物固氮:

N₂ + 8H⁺ + 8e⁻→2 NH3 + H₂     (1)

生物固氮生物固氮过程需要大量能量，即每个固定的氮分子至少需要16个ATP(每个转移的电子需要2个ATP)。因此，它被严格管制，仅在缺乏生物有效氮的情况下使用。由于固氮酶被氧气不可逆地灭活，微生物可以通过时间或空间分离策略来避免氧气，如分离氮气固定和含氧光合作用、避免氧气、高呼吸速率消耗氧气、使用氧气转运体来缓冲局部氧气浓度。氢气是生物固氮反应的一种专一副产物，大约消耗35%的用于生物固氮的电子通量，导致豆科植物根际环境中的局部氢气积累。由于它们存在互补结果，生物固氮和氢氧化通常联系在一起，因为氢气氧化与氧气还原耦合，且弥补部分用于固定氮气的部分ATP，导致氧气压力降低氢气的积累，低氧高氢两种情况都具有抑制固氮的作用。此外，微生物使用三种生物固氮策略，包括共生固氮、植物相关固氮和自由生活固氮。与其他固氮植物不同，大多数豆科植物的共生体不具备利用固氮产生氢气的遗传能力(即缺乏氢气摄取活性)。有学者认为，氢气提供的额外能量输入发挥了促进植物生长的施肥效应。

3、缺氧生态系统对氢气的利用。

在缺氧生态系统中，许多微生物官能团根据其有效性和潜在的热力学约束，将氢气作为电子供体来减少末端电子受体。本节讨论从醋酸生成到反硝化的氧化还原电位顺序递增的一些电子受体，尽管其他电子受体可以偶联到氢气氧化，如MnO2和CrO4。这些微生物中有许多是兼性厌氧菌，然而这些过程只在缺氧生态系统中进行，因为在热力学上，氧气得电子还原比其他电子受体更有利。这些官能团并不是相互排斥的，即许多细菌和古菌能够使用多个电子受体进行氢气氧化。

(1)产乙酸菌。醋酸生成是由来自细菌和古菌生活区的几个严格的厌氧菌进行的。醋酸菌存在于各种各样的生态系统中:湿地、动物胃肠道、海洋、地下沉积物、高盐水域和含氧土壤。虽然后者听起来违反直觉，但由于不同的机制，一些乙醛和产甲烷菌可以在氧气存在下存活。大多数产乙酸菌，即Clostridium spp.，属于厚壁菌门，但也有一些在其他门中发现，包括古菌门Bathyarchaeota。醋酸生成反应(公式2)遵循Wood-Ljungdahl将一碳无机化合物(二氧化碳)转化为二碳有机化合物(醋酸酯)的途径:

2CO₂ + 4H₂⇌CH3COO⁻+ H⁺+ 2H₂O   （2）

产乙酸菌能清除有机物降解产生的氢气。产乙酸菌面临产甲烷菌的激烈竞争，产甲烷菌的氢气利用率门槛较低，能量产量较高。在某些生态系统中，醋酸菌可以战胜产甲烷菌，比如白蚁肠道，因为醋酸菌的生产在其动物宿主中具有生态优势。通过耦合利用二氧化碳和氢气, 产乙酸菌内在地参与了氢气和碳循环过程。反过来，这会导致醋酸盐的产生，这是周围微生物群落的生物可利用的碳源。作为严格厌氧菌或兼性厌氧菌，醋酸菌也可以通过发酵利用溶解的有机物，产生自己的氢气和二氧化碳。此外，梭状芽胞杆菌和德雷克氏梭菌，也参与一氧化碳氧化成二氧化碳，结晶纤维素和半纤维素降解，聚合有机物的转换，和腐殖酸分解。

(2)产甲烷菌。产甲烷古菌只在湿地、动物肠道、极端环境，如温泉和热液喷口中常见，甚至在含氧土壤中也常见。甲烷菌由唯一含有[Fe]-氢化酶的官能团组成，这使它们能够使用氢气作为还原剂，依赖铁氧还原蛋白将二氧化碳还原为甲烷，反应如下:

CO₂+4H₂→4CH₄+ 2H₂O    （3）

产甲烷菌在生态系统或生态系统内的各层中茁壮成长，在这些生态系统中，硫酸盐和硝酸盐等具有较高氧化还原电位的电子受体由于二氧化碳的低氧化还原电位而被耗尽。它们能有效清除有机物降解过程中产生的二氧化碳和氢气，这些物质可以自行发酵。利用电子分叉的氢营养产甲烷菌被认为是专性自养生物。使用氧化磷酸化的甲基营养产甲烷菌消耗更多种类的底物。然而，最近的研究表明，氢营养产甲烷菌，如海洋产甲烷菌maripaludis(广古菌门)，实际上可能比最初认为的更有灵活性，也能使用一氧化碳和甲酸的组合，而不仅仅是二氧化碳和氢气。“Candidatus Methanothrix paradoxum”(广古菌门)(非氢营养)的发现也挑战了产甲烷菌是严格厌氧菌的假设。产甲烷菌在碳循环中的参与还包括它们减少腐殖酸的能力，例如在Methanosarcina barkeri(广古菌门)中，这暂时降低了它们的产甲烷潜力。研究表明厌氧产甲烷古菌(ANME)也可能是产甲烷菌。

(3)硫酸盐还原菌和古菌。硫酸盐还原菌(SRB),如脱磷孤菌属种虫害和Desulfotomaculum spp(门壁厚菌门)，以及硫酸盐还原古生菌(SRA),如Archaeoglobus spp(门Euryarchaeota),是厌氧微生物的氧化耦合氢气(或有机化合物)还原硫酸盐(SO42−)为硫化化合物。虽然硫酸盐还原微生物存在于沿海沉积物等缺氧环境中，但它们在海洋和淡水沉积物、深层地下环境以及动物的胃肠道中更为常见。它们也存在于酸性矿井排水和碱性环境中，如碱湖。在同一生态系统中，利用氢气的硫酸盐还原剂由于其较高生长动力学，可胜过乙酰原和产甲烷菌。脱硫杆菌(厚壁菌门)的种类也能够进行腐殖酸和多芳香族化合物的还原。研究还显示了它们固定二氧化碳和氧化一氧化碳的潜在能力。硫酸盐还原微生物被认为是海洋沉积物中碳循环的主要驱动因素。氢气氧化SRB还作为菌群中的同养菌，对甲烷进行厌氧氧化。

(4)铁氧化物还原菌。铁氧化物还原细菌和古菌[铁(III)还原物]存在于土壤、酸性矿山废水、水生沉积物、温泉和地下生态系统中。由于Fe(III)不溶于水，微生物需要直接与Fe(III)接触来还原它。希瓦氏菌(变形菌门)、地杆菌(变形菌门)和酸杆菌(酸杆菌门)等微生物可以产生螯合剂来溶解水中的铁(III)，甚至产生导电的细菌纳米线来达到铁。它们使用Fe(III)作为有机物或氢气氧化的电子受体。许多Fe(III)还原菌也使用其他电子受体，如氧气, SO42−，NO3−，甚至一氧化碳和二氧化碳。这些Fe(III)还原菌包括细菌，如地杆菌属和希瓦氏菌属，也包括产甲烷菌属和其他古菌，如岛焦杆菌属(克雷那古菌门)。Fe(III)还原过程清除氢气的效率高于硫酸盐还原过程。几种Fe(III)还原剂可以利用腐殖质作为电子受体进行厌氧氧化有机化合物(例如，由醋酸菌产生的醋酸)以及支持其生长的氢气。这种电子转移也螯合铁(III)氧化物，使它们对铁(III)还原菌具有生物可用性，如geoobacter metalreducens，可用于污染物的降解(如苯)。

(5)反硝化细菌和古菌。反硝化细菌和古菌耦合硝酸盐(NO3−)的还原，随后将氮化合物还原为氢气(或有机化合物)的氧化。在水生和陆地生态系统中，反硝化作用主要由异养微生物进行，如反硝化副球菌(变形菌门)，但在自养微生物中也很常见，如反硝化硫杆菌(变形菌门)，或在喜氢目(变形菌门)内。它是最积极的厌氧呼吸过程，并被广泛的微生物使用。由于反硝化是在大量的顺序还原反应中进行的，典型的是NO3−→NO2−→NO→N2O→N2，许多反硝化微生物并不具备进行完全反硝化的完整代谢途径。在一个单一生态系统中，不同微生物菌株经常补充它们的反硝化能力，以更有效地能源回收和避免有毒的N中间体。假单胞菌(Pseudomonas spp.， Proteobacteria)可以进行反硝化和POM降解，包括降解木质素和芳香化合物。与SRB一样，一些反硝化细菌也是AOM分解的共养菌。

4、有氧生态系统对氢气的利用。

在通气充分得土壤中，大部分氢气由Knallgas细菌氧化，主要是因为这种细菌具有高亲和力的氢气摄取能力能对大气中极低浓度氢气进行有效分解(大气氢气浓度约0.53 ppmv)。

大气氢气浓度参考文献Novelli PC, Lang PM, Masarie KA, Hurst DF, Myers R, Elkins JW. 1999. Molecular hydrogen in the troposphere: global distribution and budget. J Geophys Res 104:30427–30444.

(1)Knallgas细菌。Knallgas细菌是水生和陆生专性或兼性化能岩自养生物，利用氧气作为最终电子受体，根据Knallgas反应氧化氢气:

H2 + O2⇌H2O   （4)

模型Knallgas微生物包括C. necator(原Ralstonia eutropha)，它具有4种[NiFe]-氢酶，来自1、2、3和5群，但并不是所有的Knallgas细菌都有几种氢酶。虽然C. necator具有5组 [NiFe]-氢化酶，但它不能氧化大气中氢气，因此不是HA-HOB，与耻垢分枝杆菌相反。当氢气浓度足够高时，C. necator利用其1 组[NiFe]-氢化酶固定二氧化碳并氧化氢气作为其唯一的能量来源。3组 [NiFe]-氢化酶主要是通过将氢气氧化与NAD+还原结合来维持细胞内氧化还原平衡。为了避免在氢气混合比例较低情况下使用1组和3组氢化酶造成的能量浪费，C. necator也产生2组氢化酶，该氢化酶能作为一个传感器调节其他两种氢化酶的结构和辅助基因的转录。最后，5组氢化酶产生ATP的速率低于MBH(1组)，但对氧气完全不敏感。其他Knallgas细菌具有类似的氢气吸收机制，包含各种系统发育背景(如变形菌门、厚壁菌门、蓝藻门、绿藻门和酸杆菌门)。此外，许多固氮的微生物，即放线菌属植物的共生体Frankia spp.(门放线菌门)和Cyanobacteria，可以氧化通过固氮过程产生的氢气。各种Knallgas细菌也被称为植物生长促进根内细菌(PGPR)，而更多的细菌执行关键的碳循环步骤。几种Knallgas细菌可以分解聚合物化合物。例如，假硬芽孢杆菌和耐热芽孢杆菌在氧化Fe(III)氧化物时可以减少腐殖酸，而伯克霍尔德氏菌(变形菌门)可以分解木质素。此外，许多甲烷营养体，如毛孢甲基窦菌(Proteobacteria门)和fumariolicum fumariolicum (Verrucomicrobia门)，可以在有氧条件下氧化氢气和甲烷，因此也属于Knallgas细菌。各种Knallgas细菌，如Hydrogenomonas facilis (Proteobacteria门)和C. necator，也可以固定二氧化碳或氧化一氧化碳。

(2)大气氢气的氧化。

由于在低氢气分压下无法分离出负责大气氢气氧化过程的微生物，长期以来人们一直认为大气氢气氧化源自非生物酶。在低混合比例下氧化氢气的细菌最近才被分离出来，因此它们在科学文献中的数量很小。最近基因组数据库调查表明，大多数具有第5组[NiFe]-氢化酶的微生物都是放线菌，如链霉菌属和分枝杆菌属。目前为止，只有少数高亲和力氢气氧化微生物被分离和表征，包括马红球菌(Rhodococcus equi)(门放线菌门)、各种链霉菌和耻垢分枝杆菌。在这方面，5组 [NiFe]-氢化酶在细胞内的作用尚不清楚。HA-HOB主要存在于土壤中，它们是大气氢气的主要(70%)消费者。虽然大气中的氢气提供了大量的能量，但不足以维持细菌生长。到目前为止，HA-HOB已经被证明利用氢气作为额外的能量来源，以促进生长和生存或在一种混合营养生活方式中称为生存混合营养。HA-HOB也参与了碳循环。如jostii Rhodococcus jostii和Rhodococcus equi都能降解木质素和其他几种POM化合物。链霉菌也能分解腐殖酸甚至煤，从而促进POM循环。其他放线菌，如耻垢分枝杆菌，也能氧化大气中的一氧化碳和氢气。候选类群也可能具有氧化大气氢气和固定二氧化碳的遗传潜力。

三、土壤中氢代谢细菌参与协调的氢气和碳循环

11种氢氧化菌能水解可溶性有机物DOM，也参加不溶性有机物POM分解，包括纤维素、半纤维素、木质素、腐殖酸物质,和多环芳香族化合物，以及催化氧化还原的一氧化碳, 最后上述代谢过程形成二氧化碳和甲烷(图4)。

环境生态平衡中，氢气代谢菌具有枢纽作用。因为氢气氧化菌可在不同营养、碳和能源模式之间进行切换，使它们在受到各种碳输入时具有代谢灵活性。许多碳循环过程还会产生更多简单有机物，微生物群落可代谢使用，如醋酸盐。此外，在富含氢气的微环境中，如豆科植物根际、白蚁肠道和蛇形岩宿主系统，在土壤中氢气氧化菌释放的代谢物也可能促进有机质的分解和转化。最近研究表明，土壤暴露于具有自然界代表性的高氢气浓度(即10,000 ppmv)中，可增加碳源使用量，以及在规定时间内消耗量。然而，尚不清楚参与氢气氧化的氢气氧化菌是否由于混合营养生长策略而导致了这种类似启动效应的反应，或者氢气氧化菌与异养非氢气氧化菌之间的正相互作用导致了这种反应。考虑到这一点，可以预期氢气氧化菌进行的其他碳循环过程，如分解、腐殖化和水解，在富含氢气的生态系统中也会增加(图4)。

图4 土壤氢气和碳代谢的协同性。复杂有机物水解成单体，单体通过发酵为二氧化碳，一氧化碳也可以氧化为二氧化碳，二氧化碳和氢气反应变成甲烷。11种氢气代谢细菌参与上述不同过程。氢思语：仔细观察这个过程，我们应该考虑复杂生物体如人体，氢气是否也有类似的作用？参与碳代谢的多层次协调作用，或者说氢气能参与细胞物质代谢总协调作用。

大气中也含有微量氢气，也可能参与土壤代谢协调作用。有研究表明，在耕地和森林土壤中大气一氧化碳和氢气沉降速度都是正相关的。虽然最初假设是土壤气体扩散性导致了这种结果，最近研究表明，微生物氧化氢气、一氧化碳和甲烷的电位也有协变。事实上，随着氢气暴露梯度逐渐从0.5到10,000 ppmv，低亲和性氢气氧化增加，净二氧化碳产量减少，高亲和性氢气、一氧化碳和甲烷氧化减少，这说明土壤菌氢气代谢受环境氢气浓度的影响。综上所述，富含氢气的生态系统可能是DOM和POM循环的枢纽，如果有较高的氢气浓度，氢气氧化菌优先氧化氢气，而不使用其他微量气体。

虽然不能保证原位测量能显示相同的行为，但氢气驱动的碳循环是存在的。两项研究表明，在持续供给空气或补充空气的氢气暴露期间，土壤系统出现从二氧化碳净产生到二氧化碳净固定的变化。最近的一项宏基因组调查发现在南极沙漠土壤中也有类似现象。固定二氧化碳会增加系统中有机碳输入，在细胞死亡或次生代谢产物产生后，有机碳会被分配到微生物群落的其他部分。这些研究中的参与菌株尚未确定，已知有几种Knallgas细菌可氧化氢气固定二氧化碳。虽然这些假设适用于氢气氧化二氧化碳固定微生物，但预计氢气氧化甲烷养菌也可以通过降低甲烷氧化从而增加某些代谢途径产甲烷菌净碳输入(图4)。

氢气氧化菌全面参与土壤碳循环过程，但对每个过程的相对贡献是未知的。两种不同类型的方法可以用来增加我们对氢气碳动力学的理解，菌群水平和单菌水平的方法。至于菌群层面方法，一个好的起点是将土壤(即微型群落、中观群落甚至农田)暴露于氢气的基线浓度(如，0.53ppm作为对照)，以及代表自然条件的较低或较高的氢气浓度。土壤氢气暴露可用合成混合气体，也可以利用控制豆科植物固氮产氢(分别具有Hup活性或不具有Hup活性)提供。这可以直接比较氢气可用性和碳周转率。

对于单菌层面的方法，可以进行3个实验：培养新的氢气氧化菌，对新的未培养氢气氧化菌的单细胞测序，或对未培养氢气氧化菌的宏基因组组装基因组(MAGs)进行分析。传统培养方法可更直接地测试氢气氧化菌碳循环能力，而培养方法可让我们更深入了解它们的整体通用性。此外，一些氢气和碳循环过程似乎在土壤中共同变化，如大气甲烷和升高的氢气氧化，但尚不清楚这些过程是由相同的微生物进行的，还是仅仅在相同的生态位内进行的。这三种提出的单菌层面的方法可以帮助解决这个难题，减少基因组数据库中的偏差。例如，一些类群具有更多的序列代表，因此在数据库中更有代表性，而不管它们是否参与了循环。这些方向进一步研究将有助于阐明碳和氢气循环重叠在物种和生态系统水平上的重要性，为进一步了解氢气氧化菌整体生物地球化学潜力提供参考。反过来，这一知识可用于开发利用土壤中氢气的技术，例如提高碳周转的潜力或农业效益。最后，本文中氢气氧化菌是一个还原论的概念。即氢气氧化菌不是单纯氢气氧化功能，它们的功能是高度多样化的，发挥着至关重要的生态系统功能，在生态系统层面上，这些功能可能比能量回收意义更重要。

参考文献