疫情依然严峻，全国上下一盘棋，众志成城抗病毒。

  国人都希望能做一些力所能及的贡献。

本内容主要由马教授撰写，期间多位同行参与了讨论。目前尚未在期刊发表，考虑到传播的即时性，马教授等作者决定在这里发布，希望能引起更多关注，给抗疫提供参考资料。

《SARS病毒S糖蛋白研究对应对新冠肺炎的启示》

北京工业大学生命科学学院 马雪梅 等

摘要：新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）的疫情牵动着所有人的心。目前，该疾病没有特异性治疗方法，病毒感染的恢复主要是依靠机体自身的免疫力，重症患者往往是由于突然出现的细胞因子风暴造成全身器官衰竭。尽管新冠肺炎重症比率比SARS低，但该病毒传播方式隐蔽传播能力更强，导致患者基数规模大，重症病人救治难度依然十分严峻。目前，药物的研究靶点多是针对病毒本身，主要以对症治疗为主，氧疗、机械通气、经验性使用抗生素和奥司他韦抗病毒，是目前使用的主要手段，部分患者使用免疫球蛋白输注、糖皮质激素治疗、人工肺（ECMO）等手段。新冠肺炎以细胞因子风暴为主要特征，对病毒免疫学特点的研究对应对疾病具有特别重要的意义，但到目前为止仍然比较少。过去对SARS病毒的研究表明，在病毒清除前出现抗病毒S糖蛋白抗体（S-IgG）可以消除伤口愈合巨噬细胞反应，并促进 IL-6、MCP1 和 IL-8 的产生以及促炎性单核细胞/巨噬细胞的募集和积累，死亡患者S-IgG比康复患者首次出现更早，滴度更高，提示S-IgG和巨噬细胞在细胞因子风暴中可能具有重要作用。考虑到2019-nCoV与SARS-CoV的S糖蛋白同源性高，对新冠肺炎临床治疗和药物研究来说，S糖蛋白反应产生的免疫反应需要引起特别关注，除了针对病毒本身的药物筛选，S-IgG抗体、巨噬细胞FcγR等是值得尝试的靶点。

2019新型冠状病毒于2019年在武汉病毒性肺炎病例中被发现，2020年1月12日由世界卫生组织命名为2019-nCoV，2020年2月11日由世界卫生组织正式命名为COVID-19。复旦大学张永振教授领导科研团队破译其基因序列，并于virological.org网站上公开发表。石正丽团队发现2019-nCoV全基因组与SARS-CoV的序列同源性约76%，通过对其保守的7个非结构蛋白进行对比，确认2019-nCoV和SARS-CoV同属于冠状病毒β属，病毒spike糖蛋白(S)与宿主细胞受体血管紧张素转化酶II（ACE-2）结合而侵入机体[1,2]。冠状病毒作为一个大的病毒家族，是具外膜(envelope)的单股正链RNA病毒。该病毒已知可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)及严重急性呼吸综合征(SARS)等。病毒有包膜，包膜上存在棘突（spike），整个病毒像日冕，不同冠状病毒的棘突有明显的差异。

有意思的是，与SARS-CoV和MERS-CoV的患者相似，一些2019-nCoV的患者会出现急性呼吸窘迫综合征（ARDS），影像学上特征性的肺毛玻璃改变。 在大多数危重患者中，2019-nCoV感染还与细胞因子风暴有关，其特征是白细胞介素2、7和10，粒细胞集落刺激因子，干扰素γ诱导型蛋白10，单核细胞趋化蛋白的血浆浓度升高。巨噬细胞炎症蛋白1α和肿瘤坏死因子α，提示可以从SARS的病理特征和诊治中获得一些有益的提示[3]。

图1. 2019-nCoV 3D示意图（图片来源网络）

SARS 患者表现出急性肺损伤（ALI）的特征，包括弥漫性肺泡损伤（DAD），上皮坏死以及纤维蛋白和玻璃样沉积。大多数死于SARS的患者会发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），这是 ALI 的最严重形式，2019-nCoV和MERS等病毒具有相似的特征，它们的爆发也凸显了研究病毒介导的ALI或ARDS机制的重要性。

ARDS 的基础是肺部炎症的急性发作，它与单核细胞/巨噬细胞的极化和功能密切相关. 肺巨噬细胞是高度可塑性的异质细胞，它们驻留在肺间质和肺泡中或在炎症刺激后募集。ARDS急性期炎性单核细胞和常驻组织巨噬细胞在炎症引发、维持以及康复中起关键作用。在稳定状态下，常驻巨噬细胞通常处于静止状态以防止损害肺泡，并在正常组织的动态平衡中起重要作用。组织受伤后或感染期间，常驻巨噬细胞被激活，循环单核细胞被募集到损伤部位。炎性单核细胞/巨噬细胞（IMMs）和常驻巨噬细胞发生明显的表型和功能性变化，它们可分为促炎（M1 或经典激活）和抑炎（M2，或其他激活，伤口愈合或抗炎性）巨噬细胞。在急性感染期间，单核细胞/巨噬细胞通常表现出M1型。这些细胞介导宿主对病毒的防御，并通过产生一氧化氮（NO），ROS，IL-1，IL-6 和 IL-8和 TNF等促进肺损伤。同时，一些巨噬细胞可能会被激活，通过产生基质金属蛋白酶（MMP），生长因子和抗炎细胞因子尤其是 TGF-β发挥抗炎功能并调节伤口愈合。当病原体或炎性刺激消除时，促炎性巨噬细胞减少，巨噬细胞群体主要是伤口愈合的表型。在最终恢复阶段，巨噬细胞显示出调节/抑制表型，IL-10的分泌水平增加，这有助于伤口愈合并恢复平衡。当伤口愈合反应得到控制时，炎症反应会迅速消退，并且正常组织结构也将恢复。伤口愈合反应的紊乱可能导致炎症介质的产生失控引发持续性损伤。在最终死于SARS的患者中，广泛的肺损伤与高初始病毒载量，肺中IMs增加以及血清促炎细胞因子（IL-1，IL-6，IL-8，CXCL-10 和 MCP1）水平升高相关。

现在对2019-CoV的免疫应答特征知之甚少，由于其与SARS-CoV有一定的同源性，我们可以参照SARS病毒的特性来分析2019-nCoV的免疫学特征，以期对疾病的治疗和药物的研究有所启示。对SARS 急性感染期的早期免疫事件研究尚少，使用非人灵长类动物和患者标本研究急性感染和 ALI期间巨噬细胞异质性和功能的报道非常有限，驱动侵袭性炎症的因素仍然难以捉摸，我们主要关注两个研究方向：1）SARS-CoV的抗体反应与病人的预后相关[4，5]；2）在急性 SARS-CoV感染过程中抗病毒S糖蛋白IgG扰乱巨噬细胞反应而导致严重的急性肺损伤[6]。

1、抗SARS病毒的抗体反应与感染患者的预后相关

在SARS-CoV的抗体反应与病人的预后报告中[4]，作者对从 SARS-CoV 感染中康复或死亡的感染患者的 N 蛋白特异性抗体和S糖蛋白特异性抗体反应的时间变化进行了表征，发现在康复患者中，10到15天就可以检测到针对 N 蛋白的抗体，在症状发作后的20天左右达到峰值，并持续高水平。但是在死亡的患者中，N 蛋白特异性抗体在最初的2-3周内从未产生或在起始阶段产生，随后急剧下降。

在针对 SARS-CoV Spark糖蛋白（S）中和性抗体（Nab）反应的分析中发现，在症状发作后的前 10-15 天中，康复患者和死者的血浆均达到可检测的水平，死者的抗 S NAb反应的发展速度明显快于康复患者. 康复的患者平均需要20天才能达到其 NAb活性峰值，而死者仅需14.7天，在同一时期内，已故患者的实际 NAb 滴度明显高于康复患者。康复的患者在症状发作后的第 20 天仍具有较高的 Nab 水平并达到峰值，但病死患者在症状发作15天后抗 S糖蛋白特异性 NAb急剧降低。这些结果表明，抗 S 糖蛋白特异性Nab在 SARS-CoV 介导的急性感染ALI中起作用，与患者的康复相关。

来自台湾的一个研究[4]对347例SARS病人的分析表明，临床病程较重的患者具有较早和较高的抗体反应，这些早期反应者的死亡率显著高于到第三周或更往后还没有发生血清转化的患者（29.6％比 7.8％），这些早期反应者也倾向于在急性期早期死亡：8 个患者中有 6 个在患病的前 2 周内死亡，另2 个分别在患病的第 15 天和 17 天死亡。男性患者比女性患者有更高的抗体滴度，年龄较大的患者更可能早应答（平均年龄43.7岁：37.3 岁）大，早应答的患者中年龄大于 60 岁的患者占60％，而年龄小于60 岁的患者中占16.3％。早期抗体应答的原因还不清楚，一种可能性是先前非 SARS-CoV 感染交叉反应抗原引发的作用，年龄大的人有更多机会接触更多的抗原种类。

钟南山团队对全国31个省市552家医院中的1099例（截至1月29日）确诊新冠肺炎病例的回顾性研究显示，患者的中位年龄为47.0岁，女性患者占比41.9% [7]。在另一项迄今为止规模最大的新型冠状病毒临床回顾性研究中，数据截至1月26日，涉及8866个病例，包括30个省区市上报的4021个（45.35%）实验室确诊病例和4845名疑似患者，确诊的重症患者死亡率为5.88%。死亡的男性患者是女性的3倍（4.45%∶ 1.25%）。值得注意的是，在诊断为重症肺炎的60岁及以上老年男性患者中，病死率高达9.47%[8]。与上述SARS患者的研究有一致性，男性患者比例高的原因值得深入研究，是否与ACE2在不同群体和不同组织器官的分布情况相关尚还缺少相关数据。

在 2009 年流感大流行期间，预先存在于血清中的针对流感抗原的抗体与更严重的临床严重程度和较差的预后相关。此外，在小鼠和非洲绿猴中进行的研究发现，多种疫苗和病毒感染似乎可诱导 SARS-CoV 特异性免疫记忆，增强肺部炎症反应，但病毒特异性抗体应答在 SARS 冠状病毒引起的肺损伤中的作用尚未明确。

图2.SARS病人不同时间中和性抗体（Nab）随时间的变化[4]

2、抗病毒S糖蛋白IgG扰乱巨噬细胞反应导致严重的急性肺损伤

Li等[5]2019年发表在JCI insight的一篇研究提供了线索，作者认为在急性 SARS-CoV 感染过程中抗S糖蛋白 IgG （S-IgG)通过干扰巨噬细胞反应而导致严重的急性肺损伤，提示抗S-IgG和巨噬细胞在炎症风暴中有重要作用。在这个研究中作者提供了在SARS-CoV 感染造成ALI中S-IgG有害的证据。

在急性 SARS-CoV 感染期间，抗 S-IgG 引起严重的肺损伤。研究选用猕猴，为了确定S-IgG对 SARS-CoV 介导的肺损伤程度的影响，分别注射 5 mg（低剂量）和 200 mg（高剂量）纯化的S-IgG，发现S-IgG 可以明显降低病毒滴度，但所有 S-IgG 处理动物均表现出急性 DAD 症状，具有不同程度的渗出，透明膜形成以及肺泡内出血和炎性反应。值得注意的是，尽管在感染阶段存在高滴度的血清NAb，5 个对照（C-IgG）中仅有1 个出现DAD 症状，这表明S-IgG 可能主要在SARS-CoV 感染急性期发生作用，导致严重的 ALI，并持续至疾病晚期。

渗出液（红色箭头），透明膜（黑色箭头）和大量细胞浸润（黄色箭头）

图3. 抗S-IgG抗体在 SARS-CoV 感染的中国恒河猴中诱导 ALI[6]

在急性 SARS-CoV 感染过程中，S-IgG 治疗会使伤口愈合巨噬细胞反应产生偏差。与未用 S-IgG处理的猕猴相比，S-IgG 增加了IMMs在肺中的浸润和积累，S-IgG 接受者的 IMMs（MAC387 ⁺和 CD163 ⁺HAM56^–）数量显著增加。许多新募集的 MAC387⁺HAM56^–单核细胞/巨噬细胞没有共表达 CD163，代表最新募集的血液单核细胞，这是由于 S-IgG 增强了单核细胞浸润的结果（图3）。大多数 CD163⁺HAM56^–IMM 共表达 CD68，表明 S-IgG改变了该亚群的功能。此外，S-IgG 处理猕猴肺部的常驻巨噬细胞（CD68⁺ HAM56⁺）不再表达 CD206，CD206 被许多 CD163⁺IMM 包围，提示其伤口愈合功能丧失，并在募集血液单核细胞中发挥作用。所有巨噬细胞亚群中均表现出 TGF-β 缺失和 IL-6 高表达，表现出促炎表型增强。

病毒 NP 和单核细胞/巨噬细胞的代表性图像。与 C-IgG 组相比，S-IgG 组的肺部 IMM 显着增加（MAC387+，CD163+或CD68+；蓝色箭头）。

图4.SARS-CoV感染和 S-IgG 处理的猕猴肺经单核细胞/巨噬细胞浸润[6]

为了进一步确定在 SARS-CoV 感染过程中 S-IgG 是否改变伤口愈合巨噬细胞功能，研究者使用 SARS-CoV 假病毒将体外极化的交替激活的人类单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）进行了 20 小时的处理，给予 S-IgG 血清后，IL-6 升高 10 倍以上，MCP1升高 8 倍， IL-8 升高 5 倍。当用健康猕猴的血清时，未观察到这种增强，表明 S-IgG（而非其他血清成分）通过交替激活的 MDM 增强了 SARS-CoV 刺激的细胞因子产生。但 S-IgG 血清对经典激活 MDM没有影响。病毒感染时，伤口愈合的巨噬细胞产生 IL-8 和少量的 MCP1 以募集嗜中性粒细胞和血液单核细胞，而在S-IgG存在时伤口愈合巨噬细胞产生的IL-8，MCP1 和 IL-6 可以增加 5 至 10 倍，持续导致单核细胞浸润和组织损伤显着增强。

在存在 Fcγ受体（FcγR）阻断抗体的情况下，当用 SARS-CoV 假病毒或病死的SARS 患者的血清（1:4,000 稀释）处理细胞，IL-8 的产量显着降低，表明S-IgG 可能部分通过 FcγR 影响伤口愈合反应。这些结果表明S-IgG 在急性感染过程中直接修饰了交替激活的巨噬细胞的功能反应，从而使伤口愈合反应产生偏移，导致高细胞血症，侵袭性炎症和严重的肺损伤（图6）。对 FcγRs 的阻断降低了促炎细胞因子的产生，表明 FcγRs 在活化的巨噬细胞重编程中发挥作用。FcγRs 在功能上分为激活受体和抑制受体,激活 FcγRs，例如 FcγRI，FcγRIIA 和 FcγRIII，会通过其胞质结构域中的基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM）和SRC、SYK来促进促炎趋化因子和细胞因子的产生；而抑制FcγR（FcγRIIB），在其胞质内域具有基于免疫酪氨酸的抑制基序（ITIM），可抵消由激活FcγR 介导的信号。人类单核细胞衍生的伤口愈合巨噬细胞表达较高水平的 CD16（FcγRIII）和 CD32A（FcγRIIA）， 因此，S-IgG 可能通过 FcγRI 和/或 FcγRIIA 促进促炎细胞因子的产生。

图5. 阻断人 FcγR 会降低抗血清增强的 IL-8和 MCP1 的分泌[6]

呼吸道冠状病毒感染对免疫系统构成了独特的挑战：不仅必须迅速消除病毒，而且还必须控制肺部炎症以防止急性呼吸衰竭。S-IgG 尽管可以明显降低病毒滴度，却在感染的早期阶段引起了肺损伤，主要是通过消除伤口愈合的巨噬细胞反应和 TGF-β 产生，同时促进促炎性细胞因子 IL-8，和 MCP1 的产生和炎性巨噬细胞的积累。这表明在急性感染过程中可能需要调节抗 S抗体反应或阻滞FcγR是有效治疗呼吸道冠状病毒一种方式。

猕猴的 SARS-CoV 感染通常是大多数猕猴具有轻度肺部病变的病毒复制。病毒复制在接种后24 至 48 小时内达到峰值，并在 7 天内减弱，因此在肺部炎症和高滴度抗体之间产生了间隔，尽管 SARS-CoV 感染导致肺中巨噬细胞大量浸润，但是在病毒清除后巨噬细胞的数量迅速减少，在 7 天 时，炎症似乎已基本解决，这可能是发展为 ALI的比例少的原因。

在 SARS 患者中，病毒复制的效率较低，重症患者S-IgG出现的时间早且滴度高[4，5]，病毒载量的峰值与抗体首次出现时间相吻合，可能是人感染SARS-CoV 发展为 ALI比例高的原因。考虑到2019-nCoV患者炎症风暴反应与SARS相似性，S糖蛋白的免疫反应规律以及组织巨噬细胞的变化规律应该引起关注，S-IgG抗体、康复病人抗体作为治疗手段的时机需要慎重评估，疫苗制备和评估也应该高度重视。除了针对病毒本身的药物筛选，S-IgG抗体、FcγR是值得尝试的靶点。

1．Li W, Moore MJ, Vasilieva N, et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.Nature. 2003 Nov 27;426(6965):450-4.

2．Xu X, Chen P, Wang J,et al.Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission.Sci China Life Sci. 2020 Jan 21. doi: 10.1007/s11427-020-1637-5.

3．Zumla A, Hui DS, Azhar EI, Memish ZA, Maeurer M. Reducing mortality from 2019-nCoV: host-directed therapies should be an option. Lancet. 2020. pii:S0140-6736(20)30305-6.

4．Zhang L, Zhang F, Yu W, et al. Antibody responses against SARS coronavirus are correlated with disease outcome of infected individuals[J]. Journal of medical virology, 2006, 78(1):1-8.

5．Ho M S , Chen W J , Chen H Y , et al. Neutralizing Antibody Response and SARS Severity[J]. Emerging Infectious Diseases, 2005, 11(11):1730-1737.

6．Anti-spike IgG causes severe acute lung injury by skewing macrophage responses during acute SARS-CoV infection.[J]. JCI insight, 2019, 4(4):e123158.