大脑神经活动成像的经典方法是神经电活动纪录和电活动成像技术，成像技术一般是利用电活动产生相关生化改变，例如脑功能磁共振成像技术就是利用神经活动对脑血流的影响，进一步引起局部血氧饱和度的变化作为成像信号基础，也有一些学者利用钙离子水平进行荧光成像，也有学者利用细胞膜电位改变作为信号进行荧光成像。电活动的纪录最早是脑电波，然后是神经电极直接采集神经元电活动，现在科学家可以同时进行大规模多神经元活体纪录。这些技术的进步对大脑功能对大脑功能的研究提供了技术的支持，也给未来神经疾病的治疗提供了技术储备。本文主要对最新神经电活动成像技术进行介绍。

2016年9月，法国地中海神经生物学研究所神经生物学家Cossart在《科学》杂志发表论文，用图像直观展示了老鼠在跑步机跑和休息状态大脑神经元活动。当大鼠在奔跑时，50个海马神经元按次序放电帮助测量行走距离。当老鼠休息，一些神经元再次放电。Cossart认为，这些神经元代表动物对自己运动过程的编码和记忆。

这代表大脑神经元回路的最新技术，过去科学家只能一次纪录少数几个神经元，现在则可以同事纪录大量神经元的活动，这是神经生物学领域的重要技术进步之一。这类技术中，有的集中在具体神经元功能，有的则关注大脑的整体功能，有一些技术已经有商品化显微镜平台，也有一些则需要科学家根据特殊需要进行订做。活体大脑成像技术主要得益于双光子成像等最新技术。这些技术可以让科学家对大脑深层组织进行观察，用荧光标记神经元放电。Cossart的最新研究是将神经元放电纪录方法和成像技术结合起来。

大脑的研究受到各个国家的重视，美国大脑研究计划重点是对大脑功能的定位研究，美国NIH与加拿大、澳大利亚和日本联合资助参与美国脑研究计划。日本的脑研究计划则重点用猴为模型对神经系统疾病进行功能磁共振等成像技术的研究。

然而这些大脑的研究也面临许多挑战，最大的挑战是大脑组织透光性不良。纽约哥伦比亚大学脑科学中心主任Rafael Yuste说，脑组织的光学特性好像是牛奶，使用光学显微镜观察神经元的同时会受到周围组织的干扰，使光线发生散射。这意味着大多数大脑研究只能观察1毫米以内的表层，因此超过这个深度就无法进行观察。研究人员一般是使用手术切除表面组织和使用光学技术用激光提高光线投放能力。

另外一个挑战是哺乳动物神经元沟通和从中尺度到微观尺度数据整合速度之快令人难以置信，哥伦比亚大学生物医学工程师伊丽莎白·希尔曼说，理想的状态显然是对每个神经元、神经纤维、树突和突触联系进行活体图像分析。科学家现在可对果蝇和斑马鱼开展这样的研究，但没有在小鼠大脑中实现。目前能对大鼠大脑进行活体成像研究神经元的放电，以及疾病和衰老对大脑这些功能的影响。

在中风过程中，血液供应中断导致神经元和神经通路破坏，利用磁共振成像可以很清楚地显示血流供应情况，功能磁共振成像可以研究运动功能。但是这种技术在临床研究比较困难，华盛顿大学医学院神经学家Jin-Moo Lee用小鼠作为模型来研究中风，寻找可能治疗方法。

由于老鼠的大脑太小，功能磁共振成像信号比较弱。Lee只好转向大脑血流供应的观察。他的同事生物医学工程师Joe Culver给他介绍了一种组织血流分析内源信号光学成像(OIS)技术。OIS技术利用血氧含量引起的色彩信号变化分析组织血液供应。含氧血因为含有丰富含氧血红蛋白呈红色，脱氧血是蓝色，穿过小鼠薄薄的颅骨用基本的光学设备就可以分析，含氧血脑组织代表血流丰富神经活动活跃。为研究神经联系，Culver利用这个技术对整个大脑皮层进行扫描，将所有神经活跃点联系起来进行整体分析，他们将这种新技术命名为功能联系内源信号光学成像fcOIS。

2014年，Culver 和 Lee利用他们的技术用于小鼠中风模型和人类大脑的研究。Culver也将fcOIS用于小鼠老年性痴呆模型的研究，研究发现两侧大脑半球联系不仅下降，而且和老年斑块沉积关系密切。神经联系下降似乎最早发生变化，甚至可以预测斑块沉积的发生区域。

Culver说，作为神经联系筛选方法这项技术显示有比较好的价值，因为能用于小鼠大脑，可以结合一些转基因动物开展研究。不过这个技术本质上仍然是分析大脑神经活动。考虑到神经元获得信号产生动作电位，会伴随钙离子从细胞外向细胞内的流动。细胞内游离钙离子浓度可以用荧光分子标记，这样就可以将神经元活动和神经纤维联系结合起来进行分析。

一、神经电活动荧光标记技术

钙离子指示剂已经成为活体大脑显微成像的核心要素，科学家可以观察每个神经元，至少可以在平面显微镜追踪神经元活动。一般使用双光子显微镜观察这种信号。标准显微镜荧光物质需要用一束光激活，任何被光线激活的分子可以发出荧光信号。双光子显微镜可以用一个更强的激光光波，荧光分子必需同时吸收两个光子才能被激活发出荧光。因为两个光子同时击中目标只有在激光焦点才容易发生，这样荧光信号就主要局限于焦点范围内。另外，长波长低能量光线更容易穿透组织内部，通过扫描穿过大脑的激光，可以进行高分辨率的脑组织成像。

不过钙离子标记仍然代表神经电活动，这种活动慢于神经通讯本身。加州大学圣地亚哥分校神经电生理学家David Kleinfeld说，神经电活动和钙离子指示剂改变存在一个的延迟。钙离子和指示剂结合也需要时间，神经生物学家Karel Svoboda估计这个延迟大约100毫秒。荧光信号衰减也需要大约半秒左右，因此这样的时间长度能发生两三个动作电位或神经冲动。Svoboda说，第七代钙指示剂预计年内就可以出现，将有希望提高反应速度，这样能进一步提高时间分辨率。但是永远不可能存在达到和动作点位同步的钙指示剂。

哈佛大学生物物理学家Adam E. Cohen正在设计更快速度神经电活动荧光指示剂，这种指示剂能标记细胞膜的去极化。

基因工程电压指示剂(GEVIs)是基于死海中一种细菌能吸收阳光的蛋白质（古紫质Archaerhodopsin）。古紫质能随着细胞膜电位改变发出荧光，Cohen等将这种蛋白改造称为GEVIs（QuasArs），但是QuasArs荧光比较弱，他们将这种分子和另一个更强荧光序列融合，制造出荧光共振(FRET)系统。Cohen小组使用这种能发出多种色彩的电压荧光指示剂，分析培养的小鼠神经元的自发和诱导膜电位。不过和钙离子指示剂类似，这种工具也不能完全达到神经电活动的速度。Cohen说GEVIs可以用远红外光谱，是对多种可见光荧光蛋白的补充。也可以结合光遗传学神经电活动刺激技术。

二、改进显微镜技术

另外一些科学家则关注改进显微镜技术，尤其是三维成像技术。因为神经元是聚集在一起共同工作，要求成像技术应该具备立体扫描能力。瑞士苏黎世大学脑研究所所长Fritjof Helmchen说，每秒10帧是比较好的基准，这是大脑工作的时间节奏，当然如果达到毫秒分辨率则更理想。

科罗拉多大学神经科学中心主任Diego Restrepo说，这要求显微镜设计者必需控制移动元件的运动速度。他的小组利用液体镜头技术控制目标的上下位移。液滴类似凸透镜具有聚焦能力，利用电场也可以控制液滴。他的小组已经能非常好地控制这种这种微小的液体镜头，这样可以在动物活动时保持视野的稳定。也可以利用改变电场对液体镜头的焦距和位置进行调整。利用这种技术结合共聚焦显微镜和纤维光系统对大脑切片进行成像，现在他们计划对小鼠大脑进行研究。

伦敦学院大学神经科学家Angus Silver发现一种方法能在改变视野过程中加速聚焦，他使用二氧化碲晶体传输兆赫声波的声光透镜聚焦激光束。这种技术仍然需要进一步改进，以接近能对每个神经元进行成像观察，现在可以达到的视野切换速度是25毫秒。

另外一个增加观察深度的策略是使用光栅显微镜技术，这种技术是用多种移动的镜头连续对一组光线进行聚焦。这种技术能在一秒内成像一到两个区域。通过一个反光镜改进光栅角度，Hillman小组将这种技术的速度提高了20倍。他们给这种技术命名为平面一致激励共聚焦技术SCAPE，用这种技术能对清醒小鼠大脑放电模式进行研究。这种技术目前已经授权给德国莱卡公司。

Yuste小组提供另外一种方案，使用空间光线调制技术，可以将激光束分解为许多小光束，每个都小光束都可以指向不同的组织部位，类似一个光梳照到样品上，显微镜对所有反射光进行采集分析，实现同时对多个视野进行观察的目的。现在的技术可以达到每秒采集10个图像的速度，他们正在加速这个过程。Yuste已经将这个技术授权给美国布鲁克和日本奥林匹斯公司。

http://www.nature.com/nature/journal/v539/n7628/full/539315a.html