肿瘤免疫微环境空间异质性：单细胞组学分析发现肿瘤边界区富集的T细胞亚群可预测肝癌患者预后 

导言：肿瘤边界区域是免疫细胞与肿瘤激烈战斗的前线，通过比较肿瘤边界区免疫微环境与癌旁区域、肿瘤内部区域免疫细胞亚群的变化，发现CD4、CD8双阳性T细胞（CD45RO+）在多数肿瘤的边界区域富集，该T细胞亚群同时表达激活、耗竭分子标志，可能是一类正在激烈战斗接近力竭的T细胞过渡状态。这类双阳性T细胞在肿瘤边界区域富集度越高，预示着肝癌患者的预后更好。 

============================================================

免疫微环境对肿瘤的发生发展、治疗预后具有重要作用，肿瘤具有立体空间结构，已有研究表明单个肿瘤不同空间部位具有很大的异质性。本研究利用流式细胞质谱技术（CyTOF）以及单细胞转录组技术，对同一肿瘤的癌旁区域、肿瘤边界区域、肿瘤内部区域的免疫细胞亚群进行了系统分析。对13个病人39个配对样本的1700多万个细胞的流式质谱数据的分析结果表明，免疫细胞亚群在三个区域存在明显的差异变化。跟先验知识一致，CD4+ Tem在肿瘤内部区域富集，CD8+ Tem则在癌旁区域富集，而Treg比例从肿瘤到癌旁区域呈现出逐渐下降的趋势。

进一步分析发现，有若干T细胞亚群在肿瘤边界区域富集，若干亚群具有CD4、CD8双阳性（CD45RO+）的特征，该亚群同时表达激活性（HLA-DR、ICOS等）、耗竭性（PD-1、CTLA4等）标志分子。免疫荧光分析验证了双阳性T细胞（以及PD-1+双阳性T细胞）在肿瘤边界区域富集，且其富集程度越高预示着肝癌患者有显著好的预后。在肝内胆管癌、肾癌等肿瘤以及小鼠肝癌模型中也都观察到了双阳性T细胞的存在。

   为深入分析双阳性T细胞亚群的特征，对肝癌微环境双阳性T细胞、CD4单阳性T细胞、CD8单阳性T细胞以及外周血T细胞（CD3+）进行了单细胞转录组与TCR分析（10X Genomics平台），结果表明双阳性T细胞还可以进一步分为11个亚群。综合基因表达的相似性以及TCR克隆型的重合程度等信息，可以初步判断双阳性细胞来源于肿瘤来源的CD4或CD8单阳性细胞。而由TCR定义的最大的几个克隆型，都存在于双阳性细胞中，且显著富集于细胞毒性最强且同时表达耗竭分子的亚群。免疫荧光实验表明，PD1+双阳性T细胞距离CD8+ T细胞显著近于CD4+ T细胞，再次提示该亚群来源于肿瘤内CD8+ T细胞。 

基于两种单细胞组学数据联合分析，该研究揭示了肝癌免疫微环境区域性分布的特征，发现在肿瘤边界区与具有特殊的T细胞亚群分布，并就其区域显著富集的CD4、CD8双阳性T细胞的分子特征、细胞功能、细胞来源等进行了研究。此项研究表明，系统分析空间分布异质性对于理解肿瘤生物机制具有重大意义。

该项研究成果发表于综合类期刊《尖端科学（Advanced Science）》，由国家肝癌科学中心、上海东方肝胆外科医院王红阳院士、陈磊课题组与清华大学古槿课题组合作完成，郑博、王东方、邱辛瑶、罗贵娟是论文并列第一作者。

论文信息：

Bo Zheng*, Dongfang Wang*, Xinyao Qiu*, Guijuan Luo*, Tong Wu, Shuai Yang, Zhixuan Li, Yanjing Zhu, Shan Wang, Rui Wu, Chengjun Sui, Ziqi Gu, Siyun Shen, Seogsong Jeong, Xuan Wu, Jin Gu#, Hongyang Wang#, Lei Chen#. Trajectory and Functional Analysis of PD‐1^high CD4⁺CD8⁺ T Cells in Hepatocellular Carcinoma by Single‐Cell Cytometry and Transcriptome Sequencing. Advanced Science 2020.

https://doi.org/10.1002/advs.202000224