线粒体的检测技术
赵敏 6096 2021-03-05
线粒体 检测技术
由于线粒体以及ROS在生理和病理过程中都起着重要作用。现在已经开发出了多种用于检测线粒体和ROS的方法，目前对线粒体的检测方法有线粒体基因组测序、呼吸控制法、线粒体ATP生成率、膜电位等方法，此外，通过电子显微镜还可以直接观察线粒体的形态、数量变化。
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线粒体功能和稳态的打破也会引发神经系统、心脏和肌肉的疾病。一般认为，细胞衰老与老年性疾病如神经退行性疾病、心脑血管疾病、糖尿病及肿瘤等关联紧密，而线粒体则通过调控细胞衰老而影响衰老相关疾病。由于线粒体以及ROS在生理和病理过程中都起着重要作用。不同的ROS，例如超氧化物（O 2 •-），过氧化氢和过氧亚硝酸盐（ONOO •-），会刺激不同的细胞信号通路，并根据其数量和亚细胞定位而导致不同的结果。现在已经开发出了多种用于检测线粒体和ROS的方法，这不仅有助于线粒体相关的科学研究也有助于临床诊断线粒体疾病。目前对线粒体的检测方法有线粒体基因组测序、呼吸控制法、线粒体ATP生成率、膜电位等方法，此外，通过电子显微镜还可以直接观察线粒体的形态、数量变化。传统的线粒体测序是基于Sanger法测序，利用线粒体特有的序列进行PCR，然后进行Sanger法测序，得到序列后与标准序列比较，这种方法由于通量低价格也相对较低，适用于线粒体遗传病的筛查。但是，由于一个细胞中线粒体数量庞大，这种方法无法精确检查线粒体突变的情况，于是引入了高通量测序（NGS）。高通量测序灵敏度高，非常适合检测线粒体的异质性、多态性，识别导致线粒体疾病的点突变、缺失突变、插入突变、倒位突变、重复突变等基因结构的改变。所以线粒体异常疾病的直接诊断策略为高通量测序技术直接检出致病基因的突变。此项检测技术主要有传统的线粒体功能检测、用Seahorse检测线粒体功能和细胞代谢和线粒体基因组衰老水平的检测技术等。（1）传统的线粒体功能检测：线粒体呼吸控制率（RCR）、ATP生成率和膜电位的检测都是通过电化学的方法，以评价线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率的权威而经典的技术方法。RCR检测既可以反映线粒体的完整程度，也可以反应氧化磷酸化效率，RCR等于由ADP磷酸化时的耗氧量除以ADP用完后的耗氧量。一般需要提前分离完整的线粒体，在密闭环境下利用氧电极法检测。正常线粒体的RCR为3至10：RCR降低意味着线粒体ATP合成功能损伤，呼吸障碍；RCR增高意味着细胞活动旺盛，代谢加快。线粒体ATP生成率（MAPR）检测也是评价线粒体完整性和功能的重要指标。此方法是利用重组荧光素酶与ATP反应后根据激发荧光来检测ATP的生成率。膜电位的检测利用线粒体JC-1试剂盒，通过JC-1在线粒体内聚集（红色荧光）或散布在buffer中并未聚集（绿色荧光）来显示线粒体的膜电位变化，也可以直接通过膜片钳技术，实时的记录细胞膜上单一的或者多个离子通道活动。（2）用Seahorse检测线粒体功能和细胞代谢：Seahorse细胞能量代谢分析仪是检测线粒体功能和细胞代谢的有力工具，可以实时且不需要任何染料或标记物的非侵入性方式测量线粒体呼吸和糖酵解。Seahorse检测时将细胞培养在专用的微孔板上，实时检测加入不同药物后线粒体功能与糖酵解的关键参数：基础呼吸，ATP生成，质子漏，最大呼吸值，能量储备能力，糖酵解能力，糖酵解能量储备能力。仪器系统会发射激光，并测量激发荧光的变化。瞬态微腔所形成的很小的体积允许实时、灵敏、精确且无损地测量参数。自动计算氧气浓度和pH的变化，并以耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）为结果。除了线粒体直接导致的疾病，线粒体的基因组、生理生化水平也会随着年龄的增长发生变化。通常认为与年龄相关的体细胞mtDNA突变是由于损伤而产生的，这种损伤和突变在衰老过程中逐渐积累，并伴随着线粒体形态变化的出现。这一理论得到了大量相关数据的支持，这些数据显示，老年人中的体细胞mtDNA突变水平高于年轻人。人的体细胞通常包含数千个mtDNA拷贝，mtDNA的复制与细胞周期无关，因此特定的mtDNA分子可以在细胞分裂时复制很多次。此外，单个细胞经常包含一种以上基因型的mtDNA，这种情况称为异质性。在致病性突变的异质性情况下，突变的mtDNA的比例将决定是否发生线粒体功能障碍。突变的mtDNA损害功能时的阈值水平通常很高，但也取决于突变的类型和位置。体细胞线粒体DNA突变水平的测量技术上比较复杂，尚无对于单个非扩增mtDNA进行测序的标准方法，因此所有可用的方案均涉及PCR和/或克隆。因此，新技术的应用主要还是通过PCR扩增，然后再针对产物进行检测或者测序。针对mtDNA大片段缺失，可以通过定量PCR的方法，如果存在突变量高于总量的5%，则可以通过Southern blot来检测。针对mtDNA全局点突变的检测，主要是通过高通量测序得到大量的序列数据，通过生物信息算法去除PCR错误和测序错误，最后得到线粒体的全局点突变，并以此来计算线粒体异质性。由于线粒体异质性与衰老以及遗传选择性有密切关系，以此来计算个体或组织的衰老程度。2014年，Balu Chacko等提出了生物能源健康指数（BHI）的概念，以检测血液白细胞的线粒体功能为核心，以综合评价目标个体的生物能功能障碍。BHI指数转化生物学的重要结果。2018年，新的研究简化了指数检测的内容，整合了核DNA和线粒体DNA编码的呼吸链酶活性和线粒体DNA拷贝数，提出了线粒体健康指数（MHI）。该方法定量检测了柠檬酸合酶（CS），细胞色素C氧化酶（COX，complex IV）和琥珀酸脱氢酶（SDH，complex II）的酶活性, 并进行了mtDNA和核DNA计数以归一化单个细胞中的线粒体数目。这项研究指出MHI可以反映出人的日常情绪和压力状态。
（内容来源：《临床实验室》 由小析姐整理编辑）
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