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激光共聚焦显微镜有激发针孔(excitation pinhole)和探测针孔(detection pinhole), 激发针孔和探测针孔共轭(共焦), 共焦点即被探测点,被探测点所在的平面为共焦平面。激发光经激发针孔后成为点光源,然后通过二色镜反射和物镜聚焦点状照射在样品上,样品被激发产生的发射光经同一物镜,聚焦在探测针孔。探测针孔后面是光电倍增管,非焦平面的光就不能通过针孔(pinhole)被光电倍增管检测。
激光共聚焦显微镜的针孔(Confocal pinhole)一般指探测针孔(detection pinhole),Confocal pinhole的直径一般自动设置成和艾里斑(airy disc)直径一致。艾里斑是点光源通过理想透镜成像时,由于衍射而在焦点处形成的光斑。中央是明亮的圆斑,周围有一组较弱的明暗相间的同心环状条纹,把其中以第一暗环为界限的中央亮斑称作艾里斑。这个光斑的大小可以用下面的公式来估计:r(airy)=0.61 λexc/NA(obj)
Confocal pinhole size=1 airy disc=best signal to noise ratio
激光共聚焦显微镜的针孔和艾里斑的直径大小一样,将有84%的聚焦光到达光电倍增管,图像的信噪比最好。Confocal是逐点激发和逐点检测,因此有更窄的点扩散函数(Point spread function, PSF.
Confocal侧向分辨率高于一般的光学显微镜,r(lateral)=0.61 λexc/NA(obj), 物镜的轴向分辨率不如侧向分辨率,r(axial)=1.4 λexcn/NA(obj)2
小的针孔将有更好的Z轴分辨率,但需更强的信号。
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GMT+8, 2024-11-29 17:25
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