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水稻转化 (来自文献http://www.springerlink.com/content/nt36q44450563406/fulltext.pdf)
配置
1. 水解酪蛋白 300 mg/L
2. 谷氨酰胺 500 mg/L
3. 脯氨酸 500 mg/L
4. 肌醇 100 mg/L
5. 蔗糖
6. PHytagel 2.6 mg/L
N6大量50毫升,B5微量5毫升,B5维生素5毫升,铁盐毫升,2,4-D母液2毫升,pH 5.8
5.1 水稻转化受体的准备
取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟,然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液(活性氯含量为1.25%)浸泡90分钟,进行表面灭菌。(灭菌时要经常搅拌) 用无菌水冲洗3-4次,沥去水备用。在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB培养基)上,
去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟,然后用0.1%升汞浸泡30分钟,进行表面灭菌(最好在摇床上进行),无菌水冲洗3-4次,再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后,放在成熟胚愈伤诱导培养基上,
成熟季节的天气;颖壳和种皮表面没有麻点 (病斑);按成熟度分开(青米优于完熟米)
注 意:粳稻不适宜用NaClO灭菌。
5.2 农杆菌的培养
将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线,
5.3 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选状态较好的继代到一定时间的水稻愈伤组织放入无菌三角瓶中,然后加入适量农杆菌悬浮液(至少保证有足够的菌液与材料接触), 室温放置20min, 并不时晃动。取出愈伤组织,在无菌滤纸上吸去多余菌液, 随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上(将诱导愈伤和继代培养时始终紧贴培养基的那一面依然朝下放置,愈伤应摆放整齐,相互之间最好不要叠放),
仔细挑选无菌、状态较好(继代培养4-5天、色泽淡黄、颗粒状)的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液,室温放置20min,并不时晃动。倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上,
5.4 抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织(也可以水洗除菌后)放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上,
现象:愈伤组织在选择培养基上出现脓状现象,导致培养失败。减少菌量和共培养后水洗并不能消除这一现象。
对策:需要从两方面把关:从继代培养开始,精心挑选愈伤组织,杜绝染菌的愈伤组织。另一方面,严把农杆菌关:农杆菌不应该多次传代,坚持用单菌落的农杆菌划线。
5.5 抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中,挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L Hygromycin的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中,挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/l hygromycin B的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现,30-40天后进一步分化出小苗。
只要愈伤组织的质量符合要求,预分化并非必需。我们省略了预分化,将抗性愈伤组织直接转到分化培养基上,不但节省了能源、昂贵的hygromycin B 和ABA,大大降低了成本,而且使转基因的时间缩短了10天。
5.6 生根、壮苗和移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约
A, 再生的转基因苗要适时移到生根培养基上,保证转基因苗在试管中生长正常。
B, 对过于细小的苗通过剪根、剪叶和再次转培,使转基因苗强壮。
C, 选苗高约10
D, 平整土地,保持水位,适当遮阴。
1,试管苗根系发达,株高约
2,选择天气:春夏季选阴天、傍晚移栽;
冬季选晴天移栽,连续阴雨天不适合移栽
3,洗根时的水温要与土温基本一致
4,洗根和移栽时不要将成丛的试管苗分开
5,平整土地,控制水面,水不能淹没植株
培养基
(1) LB培养基
Trypton |
10 |
g/L |
Yeast extract |
5 |
g/L |
NaCl |
10 |
g/L |
Agar |
15 |
g/L |
pH 7.0 |
|
|
(2) YM培养基
KH2PO4 |
0.5 |
g/L |
Mannitol |
10 |
g/L |
L-Glutamine |
2 |
g/L |
NaCl |
0.2 |
g/L |
MgSO4 |
0.2 |
g/L |
Yeast extract |
0.3 |
g/L |
Agar |
15 |
g/L |
pH 7.0 |
|
|
(3)NB基本培养基
KNO3 2830 mg/L
(NH4)2SO4 463 mg/L
KH2PO4 400 mg/L
MgSO4.7H2O 185 mg/L
CaCl2.2H2O 166 mg/L
FeSO4.7H2O 27.8mg/L
Na2EDTA 37. 5 mg/L
MnSO4.4H2O 10 mg/L
H3BO3 3 mg/L
ZnSO4.7H2O 2 mg/L
Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L
CuSO4.5H2O 0.025 mg/L
CoCl2.6H2O 0.025 mg/L
KI 0.75 mg/L
盐酸硫胺素 10 mg/L
盐酸吡哆醇 1 mg/L
烟酸 1 mg/L
肌醇 100 mg/L
水解酪蛋白 300 mg/L
谷氨酰胺 500 mg/L
脯氨酸 500 mg/L
蔗糖 30,000 mg/L
PHytagel 2.6 mg/L
pH 5.8
(4)水稻愈伤诱导及继代培养基(粳稻)
NB |
|
|
2,4-D |
0.002 |
g/L |
L-Glutamine |
0.5 |
g/L |
Proline |
0.5 |
g/L |
Casein |
0.3 |
g/L |
Sucrose |
30 |
g/L |
Gelrite |
2.6 |
g/L |
pH 5.8 |
|
|
(5)共培养培养基
NB基本培养基(不包括谷氨酰胺和脯氨酸,加
2,4-D 2 mg/L
肌醇 2 mg/L
pH 5.5-5.2
AS(acetosyringone,乙酰丁香酮) 100µM 10-20毫克/升
注释:AS于用前溶化的培养基放至
共培养液体培养基中不加2,4-D。
(6)抗性筛选培养基
NB基本培养基
2,4-D 2 mg/L
cefotaxine(头孢霉素) 500 mg/L
hygromycin B(潮霉素) 50 mg/L
pH 5.8
二筛时可适当降低头孢浓度。
(7)水稻分化培养基(粳稻)
NB |
|
|
BA |
0.002 |
g/L |
NAA |
0.0005 |
g/L |
Sucrose |
30 |
g/L |
Gelrite |
3.5-2.6 |
g/L |
pH5.8 还要加头孢300毫克/升 潮霉素50毫克/升,增加培养基的硬度和渗透压,山犁醇 |
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(8)水稻长根壮苗培养基(粳稻)
1/2 NB 无机盐 |
|
|
1/2 B5 有机 |
|
|
Sucrose |
10-15 |
g/L |
Gelrite |
2.6 |
g/L |
pH 5.8 |
|
|
(9) 20×N6大量元素母液
KNO3 |
56.6 |
g /L |
(NH4)2SO4 |
9.26 |
g /L |
KH2PO4 |
8 |
g /L |
MgSO4. 7 H2O |
3.7 |
g /L |
CaCl2.2H2O |
3.32 |
g /L |
(10) 100×B5 有机母液
Inositol (肌醇) |
10 |
g/L |
Nicotinic Acid(VB5) |
100 |
mg/L |
Pyridoxine(VB6) |
100 |
mg/L |
Thiamine(VB1) |
1 |
g/L |
注意:棕色瓶4度保存,每次配100毫升为好,肌醇在配培养基时直接加到培养基中。 |
(11)100×B5微量元素母液
H3BO3 |
300 |
mg/L |
MnSO4.H2O |
1000 |
mg/L |
CoCl2.6H2O |
2.5 |
mg/L |
CuSO4.5H2O |
2.5 |
mg/L |
ZnSO4.7H2O |
200 |
mg/L |
Na2MoO4.H2O |
25 |
mg/L |
KI |
75 |
mg/L |
12)100×MS Fe盐溶液
FeSO4•7H2O |
2.78 |
g/L |
Na2•EDTA |
3.75 |
g/L |
(13)20×MS大量元素母液
MSMgSO4.7H2O |
3.7 |
g/L |
KH2PO4 |
1.7 |
g/L |
KNO3 |
19 |
g/L |
NH4NO3 |
16.5 |
g/L |
CaCl2.2H2O |
4.4 |
g/L |
(14)100×MS微量元素母液
H3BO3 |
0.62 |
g/L |
MnSO4.4H2O |
1.56 |
g/L |
CoCl2.6H2O |
0.0025 |
g/L |
CuSO4.5H2O |
0.0025 |
g/L |
ZnSO4.7H2O |
0.86 |
g/L |
NaMoO4.H2O |
0.025 |
g/L |
KI |
0..83 |
g/L |
(15) 100×MS有机元素母液
Myoinositol |
10 |
g/L |
Nicotinic Acid(VB5) |
0.05 |
g/L |
Pyridoxine(VB6) |
0.05 |
g/L |
Thiamine(VB1) |
0.1 |
g/L |
培养基和激素母液配制方法
(1)100×MS Fe盐溶液
称取
称取
混合A液B液,加水接近1000ml;
把混合液置于微波炉内加热煮沸,混合液颜色变深,冷却到室温;
定容到
(2)0.5mg/ml 2,4-D母液的配法
称取100mg 2,4-D,置于小烧杯内;
加少量无水乙醇使之完全溶解;
把2,4-D酒精溶液缓缓加入磁力搅拌器上的水中,如果出现沉淀,需要重新配置;
定容至200ml,
(3)0.5mg/ml α-NAA母液的配法
称取100mgNAA置于小烧杯内;
用1N的KOH溶液溶解NAA;
用水定容至200ml,
(4)0.5mg/ml 6-BA母液的配法
称取100mg 6-BA置于小烧杯中;
加少量的浓盐酸,用玻棒研磨成糊状,再加入少量浓盐酸,使之完全溶解;
用水稀释并定容至200ml,
(5)
称取196.2mg As,用5ml DMSO直接溶解,并定容至10ml,分装入无菌的小管,
(6) 5mg/ml KT的配法
称取100mg kenetin,用少量1N KOH溶解,用水稀释定容至20ml。过滤灭菌后,分装入无菌小管中,
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