棉花是我国重要经济作物和纺织工业原料，在人民生活和工业生产中发挥着不可估量的作用。由于连作和极端天气频发，棉花在生长过程中频繁遭受着黄萎病等生物胁迫危害，阻碍了棉花的生长发育，限制了棉花的产量和质量。目前，鲜有特异性对大丽轮枝菌作出响应的转录因子及其分子机制被报道。

近期，河北农业大学棉花抗病遗传育种创新团队马峙英教授课题组完成的题为“Expression analysis of the R2R3-MYB gene family in upland cotton and functional study of GhMYB3D5 in regulating Verticillium wilt resistance 的研究在Journal of Integrative Agriculture (《农业科学学报》(英文)，JIA) 2024年10期正式发表。

该研究着重分析了MYB转录因子家族中R2R3型MYB转录因子对黄萎病的抗性，并鉴定出R2R3-MYB 转录因子GhMYB3D5对大丽轮枝菌有特异性反应，并能与GhADH1相互作用，形成GhMYB3D5-GhADH1模块，特异性动态上调木质素合成相关基因的表达，从而正向调控棉花对黄萎病的抗病性。研究结果将为棉花抗黄萎病分子育种提供重要的基因资源，丰富抗病分子机制。

本研究以耐病品种NDM8为研究对象，对陆地棉MYB家族成员进行了全面的分析，筛选了其中多个候选基因，利用VIGS实验，转基因拟南芥以及酵母单/双杂等实验，对候选基因的抗病功能进行了研究。研究发现，棉花中大部分R2R3型MYB转录因子在受到大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）侵染后发生显著的表达变化。其中，R2R3-MYB转录因子GhMYB3D5特异性响应V. dahliae的侵染，在感染后，上调表达的GhMYB3D5转录因子结合GhADH1基因的启动子，并激活GhADH1基因的表达；并且GhMYB3D5转录因子与GhADH1蛋白可发生物理相互作用，从而进一步增强了GhMYB3D5对其靶基因GhADH1的转录激活强度。进一步发现转录调控模块GhMYB3D5-GhADH1通过提高植株木质素生物合成相关基因（GhPAL、GhC4H、Gh4CL和GhPOD/ GhLAC）的转录水平促进木质素积累，从而增强植株对VW的抗性。

图 3 过表达GhMYB3D5可增强拟南芥对VW的抗性

A：三种转基因拟南芥植物感染大丽轮枝菌V. dahlia（Vd）和水（模拟处理）的症状。用LX2-1（107分生孢子mL^-1）接种3周龄植株。3个转基因品系在20 dpi时表现出明显的抗性提高，其中OE-1品系表现得尤为明显。此外，异位过表达GhMYB3D5对拟南芥的生长发育没有影响。B：三个转基因拟南芥系中GhMYB3D5的表达。C：20 dpi时大丽花弧菌侵染拟南芥植株真菌生物量。D：拟南芥幼苗10 dpi时，下胚轴切片维管组织在25%马铃薯葡萄糖琼脂上孵育7 天后菌丝的生长情况。E：OE系中AtPAL1/2/3的RT-PCR分析。F：OE系AtC4H的RT-PCR分析。G：OE系中At4CL1/2的RT-PCR分析。H：OE系中AtPOD的RT-PCR分析。I：OE线木质素含量。*表示P<0.05,**表示P<0.01, ***表示P<0.001。

图 5 GhMYB3D5与GhADH1相互作用，增强GhADH1的转录

A：接种大丽花弧菌可显著诱导ND601的GhADH1表达。B：GhADH1在VIGS-MYB3D5植株中的表达显著降低。C：GhADH1启动子示意图。D：基于luc系统检测GhMYB3D5在烟草叶片中的转录活性。不同构建体的根癌农杆菌GV3101侵染不同野生烟草叶区。E：酵母GhMYB3D5与GhADH1启动子相互作用的单杂交分析。F：酵母双杂交试验揭示GhMYB3D5和GhADH1之间的相互作用。上图为SD/-Trp/-Leu培养基和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/x-α-gal/ABA培养基中培养的酵母。通过酵母生长和X-a-Gal染色可以看出这种相互作用。G：复合物（GhMYB3D5和GhADH1）的转录活性与GhMYB3D5本身相比显著增强。不同构建体的根癌农杆菌GV3101侵染不同野生烟草叶区。**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图 6 GhMYB3D5和GhADH1通过介导苯丙素途径调控VW抗性

A：沉默GhMYB3D5和GhADH1导致棉花对大丽花病菌的敏感性增强。接水组（Mock）中，与对照植株相比，GhMYB3D5和GhADH1基因的沉默对植物的生长发育影响较小。B：沉默棉花GhMYB3D5和GhADH1中沉默基因的表达量分析（RT-PCR）及沉默棉花GhMYB3D5和GhADH1的病情指数（DI）。C：大丽轮枝菌在沉默植株和CK植株的生物量。D：6 hpi时棉花中苯丙烷代谢途径相关基因的表达分析。PAL:苯丙氨酸解氨酶;C4H，肉桂酸4-羟化酶;4CL, 4-香豆酸辅酶a连接酶;豆荚/虫胶、过氧化物酶和漆酶。方框表示两次重复平均后的log2(1+FPKM)值;蓝色和红色分别表示低和高转录水平。E：木质素沉积在对照棉和沉默棉茎秆横截面的组织化学分析。比例尺代表200μm。F：VIGS棉花中的木质素含量。G：沉默棉中GhPAL、Gh4CL、GhC4H和GhPOD基因表达的RT-PCR分析。*表示P<0.05, **表示P<0.01，***表示P< 0.001，****表示P<0.0001。

河北农业大学棉花抗病遗传育种创新团队马峙英教授和张艳教授为该文章的通讯作者，刘洁博士后为该文章第一作者。

该研究得到了国家重点研发计划项目（2022YFF1001403）、河北省自然科学基金项目（C2022204205）、国家自然科学基金项目（32372194）、国家拔尖人才工程和河北省拔尖人才项目的资助。

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‍https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095311924002831‍

Cite the article:Jie Liu, Zhicheng Wang, Bin Chen, Guoning Wang, Huifeng Ke, Jin Zhang, Mengjia Jiao, Yan Wang, Meixia Xie, Yanbin Li, Dongmei Zhang, Xingyi Wang, Qishen Gu, Zhengwen Sun, Liqiang Wu, Xingfen Wang, Zhiying Ma, Yan Zhang. 2024. Expression analysis of the R2R3-MYB gene family in upland cotton and functional study of GhMYB3D5 in regulating Verticillium wilt resistance. Journal of Integrative Agriculture, 23(10): 3294-3310.

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