聚乙烯亚胺（PEI）作为一种广泛应用于基因递送领域的聚合物材料，通过各种手段对其进行修饰和遮蔽以降低其细胞毒性的研究不胜枚举，但是以制备可降解PEI为目的的研究屈指可数。2015年，Englert等人考察了不同条件下PEI的氧化情况，并详细评估了氧化后PEI的结构，证实了氧化是降低PEI毒性，增强血清稳定性和可降解性的有效手段。然而，该研究没有继续探究氧化对PEI转染效率的影响，以及PEI氧化程度与转染效率之间的关系。在之后的近十年内，鲜有人报道PEI受控氧化的相关研究。相比复杂的化学改性，PEI的受控氧化是一种非常简单实用的改性方法，为增强PEI的转染性能和可降解性能提供了独特的机会。

基于上述背景，厦门大学化学化工学院田华雨教授课题组利用便捷的H₂O₂氧化法在线性PEI聚合物链引入了可降解的酰胺基团，并通过调控H₂O₂用量合成了一系列不同氧化程度的oxPEI，详细验证了PEI氧化程度与基因转染效率之间的关系，证实了合适氧化程度的oxPEI具有增强的基因转染效率、提高的可降解性和降低的细胞毒性，为PEI类材料的进一步改性和应用提供了更多可能（图1）。

图1 （a）oxPEI的合成；（b）oxPEI氧化程度与其DNA转染效率之间的关系；（c）具有合适氧化程度的oxPEI的特点。

在保持LPEI22k投料量不变的情况下，我们通过改变氧化反应中H₂O₂的用量获得了6种不同氧化程度的oxPEI22k。¹H-NMR表征结果显示，随着H₂O₂用量的增加，与聚合物主链上羰基相连的碳原子上的H的峰逐渐增强，这代表oxPEI22k的氧化程度逐渐提高。当n(H₂O₂)/n(EI)为0.05时，oxPEI22k的氧化程度为16.7%，而当n(H₂O₂)/n(EI)增大到0.53时，oxPEI22k的氧化程度随之增大到58.3%（图2）。

图2 （a）不同氧化程度oxPEI22k的¹H-NMR谱图；（b）oxPEI22k的氧化程度。

      我们在B16F10细胞中针对这些材料进行了转染评价。实验结果表明，较低氧化程度的oxPEI22k-1和oxPEI22k-2具有较好的pEGFP转染效果，优于未经氧化处理的LPEI22k。而具有较高氧化程度的4种oxPEI22k均没有表现出转染效果。我们还通过转染报告基因pGL-3来评价oxPEI22k-1和oxPEI22k-2的转染性能。转染48 h后，通过分析荧光素酶的表达量，可以得出，当oxPEI22k与pEGFP的质量比大于2.5/1时，其DNA转染效果优于未经氧化处理的LPEI22k（图3）。上述结果表明，oxPEI的氧化程度直接影响其转染效果，合适氧化程度的oxPEI具有提高的基因转染效率，优于未经氧化处理的LPEI。

图3 （a）不同氧化程度的oxPEI22k在B16F10细胞中诱导pEGFP表达的Image J定量结果。（b）不同氧化程度的oxPEI22k在B16F10细胞中介导pEGFP转染的代表性荧光图像。（c）不同氧化程度的oxPEI22k在B16F10细胞中介导pGL-3转染的结果图。比例尺：200 μm。*P<0.05，**P<0.01。

      我们继续在B16F10细胞中对oxPEI22k的细胞毒性进行评估，分别研究了单独的聚合物材料以及聚合物/DNA纳米颗粒对细胞活率的影响。聚合物材料或载DNA纳米颗粒与细胞孵育48 h后，通过CCK-8实验对细胞活性进行评估。结果表明，对于单独的聚合物材料，氧化处理后的oxPEI22k-1和oxPEI22k-2相比未经处理的LPEI22k在多种浓度下均降低了细胞毒性，改善了细胞活性。聚合物/DNA纳米颗粒也表现出同样的趋势（图4）。这些结果表明通过对LPEI进行氧化处理得到的具有合适氧化程度的oxPEI22k，不仅具有增强的pDNA转染效率，同时也改善了高分子量LPEI的细胞毒性问题。

图4 （a）LPEI22k和oxPEI22k的细胞毒性评估。（b）LPEI22k/DNA和oxPEI22k/DNA的细胞毒性评估。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

尽管转染效果和细胞相容性是LPEI被关注最多的两个性能，然而可降解性是除此之外更值得关注的第三个指标。我们分别通过胰酶处理和浓盐酸处理验证oxPEI22k的可降解性。¹H-NMR分析结果表明，与未经处理的oxPEI22k相比，经胰酶或浓盐酸处理后，聚合物链上的H的峰的积分面积明显减小，这代表聚合物主链的降解（图5）。

图5 （a）使用胰酶处理前后oxPEI22k-1的¹H-NMR谱图。（b）使用胰酶处理前后oxPEI22k-2的¹H-NMR谱图。（c）使用浓盐酸处理前后oxPEI22k-1的¹H-NMR谱图。（d）使用浓盐酸处理前后oxPEI22k-2的¹H-NMR谱图。

      为了进一步对降解处理后的oxPEI22k的分子量进行说明，我们进行了凝胶渗透色谱（GPC）分析。对于oxPEI22k-1，通过GPC流出曲线可以看出，浓盐酸处理后引起了曲线的右移，这说明降解处理后oxPEI22k-1分子量降低。对于具有更高氧化程度的oxPEI22k-2，GPC流出曲线显示经浓盐酸或胰酶处理后曲线均发生了明显右移，这证实了oxPEI22k良好的可降解性（图6）。上述研究结果共同说明了通过H₂O₂氧化法在LPEI聚合物链上引入酰胺基团，可以有效促进其在酸性条件和蛋白酶条件（模拟体内环境）下的降解。

图6 （a）降解处理前后oxPEI22k-1的GPC流出曲线。（b）降解处理前后oxPEI22k-2的GPC流出曲线。

      该工作发表在Chinese Journal of Polymer Science上。郭晓雅博士研究生和杨志宇博士是该论文的共同第一作者，田华雨教授和方华攀副教授为通信联系人。

原文信息：

Modulating the Oxidation Degree of Linear Polyethyleneimine for Preparation of Highly Efficient and Low-cytotoxicity Degradable Gene Delivery Carriers

Guo, X. Y.; Yang, Z. Y.; Fang, H. P.; Zhou, D. H.; Pang, X.; Tian, H. Y.; Chen, X. S.

Chinese J. Polym. Sci.

DOI: 10.1007/s10118-024-3171-z