淀粉样变性相关疾病主要表现为在病变组织或器官中积累蛋白质淀粉样纤维，这些聚集体以特定的肽或蛋白质为主要成分。淀粉样蛋白原纤维的过度沉积可引起与淀粉样变性相关的机体功能障碍，甚至致命。基于上述背景，南开大学化学学院史林启教授和马如江副研究员课题组通过模拟天然分子伴侣的功能，开发了一种纳米分子伴侣(nChap-NA)用于抑制蛋白质的错误折叠和纤维化。该纳米分子伴侣由嵌段共聚物PEG-b-PCL和PCL-b-P(NIPAM-co-AANTA)的自组装制备，最终得到包括配位功能基团(NTA(Zn))的PNIPAM疏水微区和亲水性PEG链组成的微相分离表面结构。PNIPAM微区能够通过疏水和配位协同作用有效捕获淀粉样蛋白单体并阻断其纤维化位点。在本研究中，以胰岛素和人胰淀素(hIAPP)为模型蛋白探究了纳米分子伴侣对淀粉样蛋白错误折叠和纤维化的抑制作用。研究表明，纳米分子伴侣能够稳定胰岛素和hIAPP的天然构象，有效抑制它们的纤维化。同时，纳米分子伴侣能够有效维持胰岛素的生物活性，并降低hIAPP纤维化聚集引起的细胞毒性。本研究希望为淀粉样变性相关疾病的预防性治疗提供新的策略。

图1 (a) nChap-NA制备示意图。(b) 纳米分子伴侣抑制淀粉样蛋白纤维化的示意图。

图2 (a) nChap-NA与不同浓度Zn(II)的紫外可见光谱。(b) nChap-NA的临界胶束浓度。(c) 25 ℃下DLS测定的nChaps的粒径分布。(d) 检测结果显示不同nChaps的散射光强随温度的变化。(e) PM、nChap-N和nChap-NA的TEM图像 (比例尺：100 nm)。

    制备成功后，ThT、动态光散射和TEM测试结果表明nChap-NA显著抑制了胰岛素的纤维化。图3 (a) 37 ℃时，胰岛素在PBS或不同nChaps存在下的ThT荧光随时间的变化。(b) 37 ℃下加入不同浓度后nChap-NA胰岛素ThT荧光随时间的变化。(c) ThT法测定不同浓度的nChap-NA抑制胰岛素纤维化的效果。(d) ThT法检测不同Zn²⁺含量的nChap-NA对胰岛素纤维化的抑制作用。(e) 37 ℃孵育0 h和12 h后，胰岛素在pH 7.4的PBS中的粒径分布。(f) 37 ℃时，加入nChap-NA后胰岛素的粒径随时间的分布。(g) 胰岛素在PBS或不同nChaps中孵育12 h的透射电镜图像 (比例尺：100 nm)。

     在此基础上，圆二色和Native-PAGE电泳测试也证明了nChap-NA对胰岛素纤维化的抑制作用。

图4 (a) 胰岛素在PBS或不同nChaps中孵育时的圆二色谱图。(b) 二级结构(α-Helix，β-Sheet，β-Turn和Random Coil)的组成。(c) 在37 ℃，胰岛素在nChap-NA中孵育不同时间的圆二色谱图。(d) Native-PAGE法评估nChap-NA对胰岛素纤维化的抑制作用。L1：胰岛素原纤维；L2：胰岛素单体；L3：加入nChap-NA孵育12 h后的胰岛素。nChap-NA捕获胰岛素对于其发挥抑制纤维化的作用是至关重要的。QCM、ANS和CLSM测试结果表明nChap-NA能够有效捕获胰岛素。

图5 (a) 37 ℃下QCM测定不同nChaps对胰岛素的响应过程。(b) 利用Sauerbrey方程计算不同nChaps吸附的胰岛素量。(c) 在PBS或nChap-NA中孵育1 h的ANS荧光强度。(d) 胰岛素在有无nChap-NA作用1 h时ANS荧光强度。(e) nChap-NA与胰岛素共定位的CLSM图像(红色：尼罗河红标记的nChap-NA；绿色：FITC-insulin；比例尺：5 μm)。

       此外，本研究还分析了nChap-NA对hIAPP的纤维化抑制作用。根据ThT和圆二色的测试结果，nChap-NA能够稳定hIAPP的天然构象，有效抑制其纤维化。并且，生物相容性的结果表明，纳米分子伴侣能够有效地维持胰岛素的生物活性，并降低hIAPP聚集引起的细胞毒性。图6 (a) 在37 ℃时，hIAPP在PBS或不同nChaps存在ThT荧光随时间的变化。(b) hIAPP在PBS中或不同nChaps中37 ℃孵育240 min的圆二色谱图。(c) hIAPP二级结构组成。(d) nChap-NA抑制hIAPP聚集进而降低神经毒性的示意图。(e) 不同浓度的nChaps的INS-1细胞毒性。(f) 在INS-1细胞中，加入hIAPP和不同nChaps的细胞存活率。

      该工作发表在Chinese Journal of Polymer Science上。王慧硕士和徐琳琳博士是该论文的第一作者，史林启教授和马如江副研究为通信联系人。

原文信息：

Nanochaperones Based on Hydrophobic Interaction and Coordination Inhibit Protein Misfolding and FibrillationWang, H.; Xu, L. L.; Shi, L. Q.; Ma, R. J.

Chinese J. Polym. Sci.

DOI: 10.1007/s10118-024-3169-6