中国农业科学 | 新疆农业大学生命科学学院刘晓东课题组联合农学院雷建峰课题组筛选靶向敲除棉花GhAGL16的sgRNAs

棉花是我国重要的经济作物，在生长发育过程中会受到各种非生物胁迫的影响，其中，干旱和土壤盐渍化是影响棉花产量和品质下降的重要因素。超表达抗旱耐盐正调控基因，培育棉花新种质是当前普遍采用的思路和方法，但是，在棉花体内还存在一些抗旱耐盐的负调控基因，获得这些基因的相应突变体材料是进一步明确基因功能、解析棉花重要农艺性状形成分子机制的关键步骤。

近期，新疆农业大学生命科学学院刘晓东课题组联合农学院雷建峰课题组完成的题为“靶向敲除棉花GhAGL16高效sgRNA的筛选”的研究在《中国农业科学》2024年第57卷6期正式发表。

根据在棉花YZ-1中A亚组和D亚组上实际克隆GhAGL16的基因组序列，预测了3个能靶向敲除GhAGL16的sgRNAs；基于棉花叶皱缩病毒（cotton leaf crumple virus，CLCrV）介导的VIGE系统，构建3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体；利用qPCR检测Cas9超表达（Cas9 over-expression，Cas9-OE）植株中Cas9的表达量，确定Cas9是否稳定遗传表达；将3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体分别转化Cas9-OE棉花子叶，并通过PCR/RE方法检测3个靶点的突变情况；利用生物信息学方法分析3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构；对突变植株进行Hi-TOM高通量测序，明确基因编辑效率。同时，对转化GhAGL16-sgRNA2的突变植株进行脱靶率鉴定，检测基因编辑的特异性。

qPCR检测Cas9表达量

成功构建了3个能同时靶向敲除GhAGL16-A亚组和GhAGL16-D亚组序列的sgRNAs。对不同Cas9-OE植株中Cas9表达量检测结果表明，Cas9在不同Cas9-OE棉株中稳定表达。用3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体转化Cas9-OE棉花子叶，PCR/RE突变检测结果表明，GhAGL16-sgRNA2可有效用于GhAGL16的靶向敲除，在棉花A亚组和D亚组靶位点上出现了不同碱基缺失的突变类型，而GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3是2个无效sgRNA。

CLCrV介导靶向敲除棉花GhAGL16

3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构分析结果表明，GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3可能存在引导序列容易与其他序列发生配对并且不易解链的现象，干扰了引导序列对目标位点的识别，导致sgRNA无效。进一步量化GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率，对每一株转化CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA2的Cas9-OE植株突变检测结果表明，在转化的9株Cas9-OE植株中有6株发生了突变，突变效率为66.67%。

GhAGL16突变单株检测

此外，Hi-TOM高通量测序结果表明，GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率为13.69%—54.42%。脱靶率鉴定结果表明，预测的4个潜在脱靶位点都没有发现脱靶现象，说明GhAGL16-sgRNA2不仅具有高效的基因编辑效率，而且具有专一的基因编辑特异性。

潜在脱靶点的检测与分析

利用CLCrV介导的VIGE系统转化Cas9-OE棉花筛选获得1个能高效敲除GhAGL16的sgRNA，为定向创制棉花agl16突变体提供了理想的sgRNA。

该研究获得国家自然科学基金（32301282、32160494）、新疆维吾尔自治区自然科学基金（2022D01B23）、自治区高校基本科研业务费科研项目（XJEDU2022J007）、新疆农业大学作物学重点学科发展基金（XNCDKY2021002）、新疆农业大学生物学创新团队开放课题（ITB202106）、新疆维吾尔自治区大学生创新创业训练计划（S202210758037）的资助。

论文链接：

《靶向敲除棉花GhAGL16高效sgRNA的筛选》

引用本文：

雷建峰, 尤扬子, 张锦恩, 代培红, 于莉, 杜正阳, 李月, 刘晓东. 靶向敲除棉花GhAGL16高效sgRNA的筛选[J]. 中国农业科学, 2024, 57(6): 1023-1033.LEI JianFeng, YOU YangZi, ZHANG JinEn, DAI PeiHong, YU Li, DU ZhengYang, LI Yue, LIU XiaoDong. Screening of High-Efficient sgRNA for Targeted Knockout of GhAGL16 Gene in Cotton[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2024, 57(6): 1023-1033.