柑橘溃疡病是一种世界性的检疫性病害，是柑橘植株所面临的最为严重的细菌性病害之一，对柑橘的生产栽培造成了严重的危害。目前，柑橘溃疡病尚无根治方法，生产中主要采取预防为主、综合防治的策略。因此，挖掘抗性基因、选育抗病品种具有重要意义。
现有栽培种中很少对柑橘溃疡病有显著抗性的品种，而湖南农业大学园艺学院/园艺作物种质创新与新品种选育教育部工程研究中心/国家柑橘改良中心长沙分中心邓子牛课题组 经过十余年的筛选，获得了能够稳定抗柑橘溃疡病的柑橘属种质——枸橼C-05，并鉴定到与枸橼C-05抗性相关的调控基因PR4A 。因此，明确枸橼C-05中存在的抗病调控基因，阐明PR4A 调控柑橘抗溃疡病的作用机理，对选育抗病柑橘种质具有重要意义。
近期， 邓子牛课题组 完成的题为“ 枸橼C-05 CmPR4A 上游转录因子CmWRKY75的筛选及其抗溃疡病功能分析 ”的研究论文在 《中国农业科学》 2023年第56卷21期正式发表。
该研究基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc 的转录组测序结果，结合实时荧光定量PCR分析PR4A 在抗病和感病种质中的表达差异，使用PlantCARE对枸橼C-05（抗病）和冰糖橙（感病）PR4A 启动子序列进行差异分析，利用酵母单杂交筛选PR4A 上游转录因子，并使用酵母回转验证、双荧光素酶验证CmPR4A 和候选转录因子的互作关系。在8种抗病和感病柑橘种质中，人工接种Xcc 后，于0、2、4、6和8 d时取注射点附近的叶片，对转录因子的表达水平进行分析，验证其与抗病的关系。通过农杆菌介导瞬时转化法，将带有35S启动子的转录因子载体在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达，使用qRT-PCR对转录因子和PR4A 表达水平进行分析，并在瞬时过表达24 h后接种Xcc ，进行Xcc 菌定量和症状观察。 抗病和感病柑橘种质叶片接种柑橘溃疡病菌后PR4A 的表达 接种 Xcc 的枸橼C-05和冰糖橙的转录组分析及定量PCR表达结果显示，在接种4、6和8 d时，抗病种质枸橼C-05中的 PR4A 表达量显著高于感病的冰糖橙。枸橼C-05和冰糖橙的 PR4A 启动子在-236 bp处存在顺式作用元件W-box的差异，以此为依据进行 CmPR4A 启动子短截并构建诱饵载体。依据自激活结果，在200 ng· mL -1 的金担子素（AbA）浓度下，以 proCmPR4A-2 为诱饵，在枸橼C-05受 Xcc 诱导下的酵母文库中进行酵母单杂交筛选，表明CmWRKY75可以与 proCmPR4A-2 互作，双荧光素酶报告系统也证实二者的互作关系，且CmWRKY75正调控 CmPR4A 的表达。
在8种柑橘种质叶片接种 Xcc 后进行 WRKY75 的表达模式分析表明， WRKY75 表达量在抗病种质枸橼C-05、美国枸橼AV、矮果香橼中显著上调，在感病种质冰糖橙、沙田柚、柠檬、南川香橼和丹娜香橼中只出现微量上调。在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达WRKY75 ，发现 PR4A 的表达量在接种4 d时显著上调且能增强叶片对 Xcc 的抗性。
不同柑橘种质叶片接种柑橘溃疡病菌后WRKY75 的表达模式 枸橼C-05转录因子CmWRKY75与 CmPR4A 启 动子互作，正调控 CmPR4A 的表达。瞬时过表达WRKY75 后能增强冰糖橙和枸橼C-05对 Xcc 的抗性，而且 WRKY75 在抗病种质中受到 Xcc 诱 导后显著上调表达，这与 PR4A 在抗病和感病种质中的变化趋势一致。枸橼 C-05 CmWRKY75 与 CmPR4A 互作调控参与抗病反应，进一步揭示了枸橼C-05抗溃疡病的分子机制。 该研究获得 国家重点研发计划（2022YFD1200503）、湖南省研究生科研创新项目（CX20210671）的资助 。 颜培涵, 罗健铭, 郝晨星, 孙紫青, 叶蓉春, 李益, 刘恋, 盛玲, 马先锋, 邓子牛. 枸橼C-05 CmPR4A 上游转录因子CmWRKY75的筛选及其抗溃疡病功能分析[J]. 中国农业科学, 2023, 56(21): 4304-4317. YAN PeiHan, LUO JianMing, HAO ChenXing, SUN ZiQing, YE RongChun, LI Yi, LIU Lian, SHENG Ling, MA XianFeng, DENG ZiNiu. Identification of the Transcription Factor WRKY75 of CmPR4A in Citron C-05 and Its Function Analysis in Resistance to Citrus Canker Disease[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(21): 4304-4317.
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