中国农业科学 | 中国兽医药品监察所陈晓春课题组建立外源性马立克氏病病毒荧光定量PCR检测方法

生物制品生产过程中涉及的动物源性原辅材料都容易引入外源微生物，特别是病毒，而外源病毒的污染，不仅给生物制品生产企业带来重大经济损失，还会影响疫苗免疫效力，甚至引发新的疫情，给下游生物制品使用企业造成灭顶之灾。实时荧光定量PCR是近年来发展起来的新型PCR技术，不仅可以定性分析，还可以对检测样品进行定量分析，具有灵敏度高、特异性强、检测迅速、重复性好等优点，已广泛应用于多种病原的检测。建立MDV实时荧光定量PCR检测方法，进而用于禽源生物制品外源性MDV的检测，对于禽源生物制品质量控制、MDV实验室分子生物学诊断等将有重要的实际临床价值。

近期，中国兽医药品监察所陈晓春课题组完成的题为“外源性马立克氏病病毒荧光定量PCR检测方法的建立”的研究论文在《中国农业科学》2023年第56卷20期正式发表。

陈晓春课题组从NCBI下载MDV 1、MDV 2和MDV 3各毒株UL19序列，进行核苷酸和氨基酸序列比对分析;分别针对MDV 1 CVI988毒株、MDV 3 FC126毒株的UL19设计特异性引物和相应的Taqman探针，建立实时荧光定量PCR检测方法;分别构建相应的重组质粒作为阳性标准品，建立标准曲线，并评价所建立方法基因拷贝数检测的灵敏度;分别对其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料（SPF鸡胚尿囊液、胚体、尿囊膜、鸡胚成纤维细胞）进行检测，评价检测方法的特异性;分别对600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006 PFU的CVI988毒株和FC126毒株进行检测，评价所建立方法检测活病毒粒子的灵敏度;分别以不同稀释度的阳性标准品质粒为模板，进行3次重复性检测，计算变异系数，分析所建立检测方法的可重复性。

不同血清型MDV UL19序列比对分析

结果显示，MDV UL19在同一血清型内核苷酸和推导的氨基酸同源性达99.99%，具有很高的保守性，在不同血清型间核苷酸同源性只有约75%，推导的氨基酸同源性只有约85%;分别建立了MDV 1和MDV 3两种实时荧光定量PCR检测方法;MDV 1检测方法标准曲线的扩增效率E=98.8%，相关系数R²=0.992，标准曲线方程Y=-3.351X+38.828（Y=Ct，X=lg（拷贝数）），MDV 3检测方法标准曲线的扩增效率E=95.0%，相关系数R²=0.998，标准曲线方程Y=-3.447X+36.496（Y=Ct，X=lg（拷贝数））;所建立的两种检测方法特异性好，MDV 1或MDV 3毒株扩增曲线良好，其他禽用病毒类生物制品、毒种、MDV 2 SB-1毒株UL19的全长质粒及生产原材料未出现特异性扩增曲线;灵敏度高，MDV 1基因拷贝数检出限度为32.8拷贝/μL，至少可检出0.006 PFU的CVI988毒株，MDV 3基因拷贝数检出限度为10 拷贝/μL，至少可检出0.006 PFU的FC126毒株;重复性好，MDV 1检测方法重复性试验的变异系数小于1%，MDV 3检测方法重复性试验的变异系数小于1.5%。

拷贝数灵敏度检测及标准曲线的建立

本研究所建立MDV 1、MDV 3实时荧光定量PCR检测方法特异性好，灵敏度高，重复性好，可作为现有外源性MDV检测方法的有效补充，用于禽用生物制品纯净性控制。

论文链接：

《外源性马立克氏病病毒荧光定量PCR检测方法的建立》